MPB：林科院袁志林组-树木共生真菌菌株纯化及快速鉴定方法

图1. 内生真菌菌丝悬浮液的纯化过程

2)孢子悬浮液纯化

a.在超净工作台中，将培养4-5 d的菌落中加入5 ml无菌的蒸馏水，使用涂布棒来回摩擦菌落表面，吸取部分1（2 ml）菌液于装有9 ml（8 ml）无菌水的无菌离心管中，利用旋涡振荡器震荡涡旋2-3 min，混匀（可根据具体情况调整时间）；

b.3层的无菌的擦镜纸过滤，除掉细小菌丝，转移滤液于10 ml的无菌离心管中，将所得的滤液涡旋震荡30 s-60 s，尽可能使孢子均匀分散；

c.取10 ml无菌离心管，加入9 ml的无菌水，转移1 ml孢子悬浮液至9 ml的无菌水中，上下颠倒4-5次，尽可能使孢子均匀分散，血球计数板计数（可根据孢子的浓度调整稀释次数），连续稀释10倍或100倍等；

d.吸100 μl稀释后悬浮液至新鲜的PDA平板上，使用涂布棒均匀涂布，25 °C黑暗培养，每个样品重复三个平板；

e.24 h后开始观察，之后间隔3-5 h观察一次，发现单菌落或单根菌丝后转移至新鲜平板上，25 °C黑暗培养，获得单菌落。

图3. 内生真菌的鉴定策略（袁志林，2010）

2.1形态学鉴定

1）产孢群体

在形态学鉴定过程中，针对不同特性的真菌种类，所采用的鉴定策略也有差别。对于产孢群体（图4）鉴定过程：

图5. 云南气霉菌株Muscodor yunnanense S18-3-1在PDA（A）和MEA（B）培养基生长的菌落特征（25 °C黑暗培养1周）[6]。

图7. 基于RPB2基因片段建立NJ进化树分析云南产气霉与炭角菌科相关类群真菌的系统发育关系。Bootstrap值>50%显示在每个分支的节点上。Creosphaeria sassafras作为外群（袁志林，2010）。

结果分析

1.产孢菌株鉴定

我们对根际壳多孢霉（Stagonosporopsis rhizophilae）的形态特征进行显微观察（图4），梨形或球状至近球状分生孢子器，无毛，无明显的小孔，直径140-280 mm，单生或(2-7)合生不规则形。分生孢子器壁3-7层，外壁由1-3层棕色橄榄色细胞组成。分生细胞呈壶状至球状，透明，光滑，4.0-6.8×5.5-10.0 μm分生孢子多数无菌，透明，椭球形，长圆形或棒状，薄壁，光滑，直径4.2-6.8×1.0-2.6 μm，通常有两个明显的油滴，之后根据分子学鉴定方法构建系统发育树（图8）。

2.非产孢菌株鉴定

产气霉菌落在PDA和MEA培养基上均呈白色（图5），但在MEA培养基上气生菌丝更致密。菌落生长速度中等，在MEA、PDA生长差别不大（表1），25 °C为最适生长温度，在30 °C抑制其生长。25 °C黑暗培养1-3周后，光学显微镜观察并未发现产孢结构和分生孢子，菌丝宽0.8-1.5 μm。

由于产气霉菌株Muscodor yunnanense的不产孢，通过分子学的多基因的系统发育分析对认识其生物学性状是十分重要的。为此，利用ITS和RPB2两个基因片段对产气霉菌株S18-3-1的系统发育关系作了分析（图6，图7）。通过Blast比对，产气霉菌株S18-3-1的ITS序列与GeBank数据库中已报道的Muscodor的5个种序列相似性比较高，其中与M. yucatanensis（FJ917287）的相似性达到98%；而且与炭角菌科中的Xylaria和Nemania等属的序列相似性也较高。但目前数据库中并没有Muscodor属真菌RPB2的序列信息，Blast比对只发现与炭角菌科中的Xylaria和Nemania等属的序列相似性较高。与模式菌株M. albus为参照来分析产气霉菌株S18-3-1和M. albus的系统发育关系。序列分析表明S18-3-1和M. albus的RPB2序列片段的差异达17%。（注：Muscodor sp. S13-1-2也是从野生稻茎杆中分离的，其ITS序列与M. albus 100%相似，RPB2序列与M. albus 99%相似，因此认为与M. albus同种）。

由图6可以看出，基于ITS序列的NJ进化树将Muscodor属真菌划分为3个亚群，其中M. albus、M. crispans和M.roseus 被归类到亚群1（100% bootstrap值支持）；M. vitigenus和一个未鉴定到中的Muscodor菌株被归类到亚群2（100% bootstrap值支持）；M. yucatanensis和Muscodor sp. S18-3-1被归类到亚群3（85% bootstrap 值支持）。同时也表明，Muscodor属真菌与Xylaria和Nemania等属的亲缘关系较相近，而与炭角菌科的其他属如Daldinia、Annulohypoxylon和Hypoxylon则亲缘关系较远。Muscodor与Xylaria和Nemania等属同属于炭角菌科的Xylarioid亚族，而Daldinia、Annulohypoxylon和Hypoxylon等属同属于炭角菌科的Hypoxyloid亚族。

溶液配方

1.2%麦芽糖提取物培养基（MEA培养基）：称取麦芽糖提取物（malt extract, Oxoid）20 g，溶解至适量超纯水中，加入琼脂15 g，定容1 L。121 °C高压灭菌25 min，常温保存。

2.马铃薯胡萝卜培养基（PCA培养基）：土豆20 g，胡萝卜25 g，切成小块，加超纯水煮烂（约30 min）后用四层纱布过滤琼脂20 g，定容1L，121 °C高压灭菌25 min（常温保存）。

3.马铃薯培养基（PDA培养基）：去皮后马铃薯200 g、切成小块，加超纯水煮烂（约30 min）后用四层纱布过滤，加入葡萄糖20 g，琼脂15 g，定容1 L，PH自然。121 °C高压灭菌25 min（常温保存）。

4.玉米粉培养基：玉米粉琼脂17 g，加1000 ml蒸馏水，煮沸1 min使其完全溶解。121 oC灭菌15 min,冷却至50 oC倒平板。

5.OA培养基：Oatmeal Agar 14.5 g，加200 ml蒸馏水，震荡混匀使其溶解，121 oC灭菌15 min,冷却至50 oC倒平板。

注：所有的培养基常温冷却至50 °C左右，加入终浓度分别为0.05 g/L和0.02 g/L的硫酸链霉素和盐酸四环素，抑制细菌污染。

6.1×PBS缓冲液：称取10×PBS粉末（上海生工）38.28 g溶于适量超纯水中，定容至4 L。用Na₂HPO₄调节pH = 7.2，121 °C高压灭菌25 min，4 °C保存备用。

7.50 mg/ml硫酸链霉素溶液（streptomycin sulfate）：streptomycin sulfate 2.5 g，超纯水50 ml（室外溶解）。

8.20 mg/ml盐酸四环素溶液：盐酸强力霉素1 g，50%的乙醇溶液50 ml，室外溶解。两种抗生素均进行过滤灭菌：使用无菌注射器吸抗生素溶液，通过孔径为0.45 μm无菌注射过滤器注入无菌烧杯中，再次通过0.22 μm的无菌注射过滤器再次过滤（注意更换滤膜），最后使用2 ml和10 ml的无菌离心管分装，-20 °C保存备用。

9.50×TAE缓冲液配制方法：称量Tris 242 g，EDTA 18.612 g于1 L烧杯中；向烧杯中加入约800 ml超纯水，充分搅拌均匀；加入57.1 ml的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容1 L后，室温保存。使用时稀释50倍或100倍 即1×TAE Buffer或0.5×TAE

10.1%琼脂糖凝胶配置：称量1 g的琼脂糖，100 ml的1×TAE缓冲液，微波炉加热溶解至无颗粒状物，冷却至50 °C左右，加入绿如蓝核酸染料，混匀后，缓慢倒入磨具，等待冷却。

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来源：刘永鑫Adam