人肝源间充质样干细胞的肝源性潜能及肝再生效应

人类肝源干细胞(hLD-SCs)被认为是不可逆肝病患者干细胞治疗的可能来源。然而，目前还不知道肝脏中的hLD-SCs是否能比从其他来源获得的间充质干细胞(MSCs)更好地向肝脏分化。在这项研究中，我们通过诱导肝分化比较了hLD-SCs和人脐带基质干细胞(hUC-MSCs)的分化能力和再生能力。未分化的hLD-SCs表达相对高水平的内胚层相关标记(GATA4和FOXA1).在两种小分子(法舒地尔和5-氮胞苷)支持的定向肝分化过程中，hLD-SCs比hUC-MSCs表现出更高级的线粒体呼吸。此外，hLD-SCs在分化的第14天具有较高数量的肝祖细胞标记物(每千成本（cost per mille）和CD133)并在第7至21天成熟为肝细胞样细胞，肝细胞标记物(白圣职衣,HNF4A，和法新社(Agence France Presse)).在体内细胞移植过程中，hLD-SCs在2 h内迁移到缺血再灌注损伤小鼠的肝脏中，减轻了肝损伤。在硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝损伤小鼠模型中，移植的hLD-SCs进入肝脏，并在14天内自发成熟为肝细胞样细胞。这些结果共同表明，hLD-SCs具有更大的肝源性潜力，肝分化诱导的hLD-SCs可能是肝再生干细胞的一个有前途的来源。   肝脏替代疗法或肝移植被认为是终末期肝病患者的金标准[一,2].然而，可用器官的短缺、高成本、移植排斥的风险以及终身免疫抑制的要求削弱了免疫监视系统并增加了肿瘤形成的发生率[3]，强制要求寻求替代恢复性办法。干细胞技术的最新进展为再生医学提供了更多可扩展的肝细胞来源，并促进了关于其潜在治疗应用的研究[四].对于肝损伤的细胞治疗，肝细胞本身已被初步研究。然而，有几个限制——肝细胞在常规环境中培养时会迅速丧失某些功能，并且在冷冻和解冻后表现出显著的丧失；此外，为了获得足够的肝细胞，进入人类肝脏受到限制[5].或者，胚胎干细胞(ESCs)一度被认为是肝细胞样细胞的可能来源，因为它们具有多能性。然而，由于法律问题和道德问题，它们的使用在许多国家仍然受到限制[6].重编程细胞或诱导多能干细胞被广泛认为是胚胎干细胞的替代物；然而，它们的缺点包括高成本和安全性问题，这限制了它们在进一步临床应用中的广泛使用[七].间充质基质细胞/干细胞可以从不同的组织中分离出来8]并有干细胞标记[9]，低免疫原性[10,11]和分化潜能[12].重要的是，间充质干细胞本质上是营养的，它们本身可以对受损组织产生再生作用，包括肝脏[13].例如，先前的研究报告称，系统性施用间充质干细胞导致其募集至缺血或损伤的肝脏区域[14,15,16].此外，已知间充质干细胞分泌肝再生相关生长因子，并可通过减轻氧化应激、抑制凋亡过程、增加血管生成和改善细胞增殖来支持肝再生[17].基于这些发现，从各种器官获得的间充质干细胞最近被探索为更可接受的肝细胞样细胞来源，特别是具有向肝源性谱系分化的能力[18,19,20].在肝脏中，肝细胞被认为来自至少两种不同的来源。一种是肝祖细胞(在啮齿动物中也称为卵圆细胞)。这些细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞，并在肝脏暴露于急性[21]或慢性损伤[22].啮齿动物卵圆细胞和人类肝祖细胞表达造血干细胞相关标记物[23,24]，提示肝祖细胞可能来源于造血干细胞。然而，肝祖细胞的起源还不清楚，仍在争论中22].众所周知，肝祖细胞位于肝内胆管树的最小分支——海林管或肝内胆管。已经广泛研究了它们在慢性和急性肝损伤中的潜在用途。如今，这些双能细胞被认为是具有高分化潜能和可扩展性的肝再生治疗的理想来源。事实上，最近关于肝再生疗法的研究已经使用化学方法将成人肝细胞去分化为肝双能细胞[25,26,27].干细胞疗法目前的另一个趋势是使用化学物质，而不是病毒或基因编辑技术，以避免因改变活生物体而引起的意想不到的副作用[28].综上所述，肝祖细胞显然是肝再生医学的一个有前途的来源。肝细胞的另一个建议来源是人肝来源的间充质样干细胞(hLD-SCs)，它不同于肝祖细胞，对造血干细胞标志物CD34呈阴性。Herrera等人于2006年报道了hLD-SCs的存在及其基本特征29]和Najimi等人，2007年[30].潘[31]和李[32]还报告了类似的hLD-SCs并研究了它们的特性。在啮齿类动物肝脏中观察到了具有类似特性的细胞[33].在王等人的综述中讨论了hLD-SCs34]和Kholodenko等人[35]，总结了它们的骨髓间充质干细胞样特性，包括分化能力、免疫抑制作用和在受损组织中的再生作用。然而，围绕hLD-SCs的进一步应用仍存在许多问题。在目前的研究中，我们跟踪了hLD-SCs肝分化过程中细胞内动力学的变化。此外，由于关于小分子的新证据表明维持或控制骨髓间充质干细胞命运的益处，我们结合小分子诱导干细胞稳定的肝分化[36].小分子可以靶向特定的信号通路来调节干细胞的命运和功能[37].与此相一致，在这项工作中，我们使用了两种不同的小分子。首先是法舒地尔，一种RhoA/ROCK信号抑制剂。已知该分子通过抑制细胞凋亡和增加内胚层分化的效率来维持融合的人骨髓间充质干细胞38,39].另一种是5-氮杂胞苷，一种脱氧核糖核酸甲基转移酶(DNMT)抑制剂。已知5-氮杂胞苷增加肝相关标记基因的表达，并增强分化的肝细胞样细胞的肝功能[40].我们还测量了肝分化过程中hLD-SCs的线粒体功能和代谢状态。还观察到在肝分化的不同时间点诱导小鼠肝损伤期间hLD-SCs在体内分化和成熟为功能性肝细胞的自发事件。总之，本研究强调了hLD-SCs的肝源性潜力以及肝分化诱导的hLD-SCs的显著治疗潜力。

2.材料和方法

2.1.人肝组织中hLD-SCs的分离

我们从访问阿桑医疗中心(韩国首尔)进行活体肝移植并同意提供研究样本的捐赠者那里获得了人类肝脏。人类肝脏捐献者的临床特征列于表1。为了分离hLD-SCs，将小块肝组织转移到冰上，悬浮在5 mL的Dulbecco改良鹰氏培养基(DMEM)/F12 (1:1)中，加入HEPES(Hyclon，GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA)，然后以500×离心g3分钟。如有必要，将标本转移到培养皿中，并在无菌条件下切成小片。除去上清液，加入5mL 0.1%胶原酶ⅳ溶液(美国纽约州格兰德岛生命科技公司吉博公司)。将组织与胶原酶溶液温育30分钟，并通过轻轻移液进行机械分离。消化后，添加10%胎牛血清(FBS然后用一个70-微米的细胞过滤器过滤悬浮液。将过滤的细胞转移到15毫升离心管中，加入10毫升培养基洗涤，并以400×离心沉淀g持续5分钟3次。将获得的细胞悬浮在添加碱性成纤维细胞生长因子的平板培养基中；Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA)通过轻轻移液，计数，并接种在明胶包被的培养板上。在维持和传代hLD-SCs的过程中，不涉及选择过程。这项工作得到了阿桑医疗中心机构审查委员会的批准(授权号2018-1386)。所有志愿者都提供了书面知情同意书。这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的。

2.2.人脐带基质干细胞和人骨髓干细胞的制备

hUC-MSCs和HBm-MSCs由干细胞中心(韩国首尔阿山医学中心阿山生命科学研究所)提供。[41,42].简而言之，人类脐带，不包括血管或羊膜，在基本必需培养基中切碎和消化(MEM；Gibco)与0.1%胶原酶A(罗氏，印第安纳波利斯，美国印第安纳州)在37℃下振荡3小时。然后，用70微米过滤器过滤细胞，并在200×离心沉淀g10分钟。将收集的细胞接种于DMEM(吉布科)，补充10%胎牛血清、100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，并在37℃的5%一氧化碳中保持2湿化培养箱。对于骨髓间充质干细胞，骨髓抽吸物取自人髂嵴，用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Gibco)，并在菲科尔-帕克PLUS上分层(密度1.077克/毫升；通用电气医疗保健，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。在400×密度梯度离心获得单核细胞g室温下培养30分钟，培养条件与人脐带间充质干细胞相同[43].对于所有干细胞，每3天更换一次生长培养基，直到细胞生长到80%汇合，此时去除非粘附细胞。使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液(Gibco)分离干细胞单层。所有涉及hUC-MSCs、hBM-MSCs和hLD-SCs的进一步分析均在第4-6代进行，并在第4和第5代汇集用于进一步研究。

2.3.人类干细胞的流式细胞分析

使用前述方法通过流式细胞术测量细胞表面蛋白质[43].hBM-MSCs、hUC-MSCs和3种不同的hLD-SCs依次与一级抗体和二级免疫荧光抗体在冷藏封闭缓冲液中孵育1小时。使用针对PE标记的CD34 (BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)、FITC标记的CD90 (Abcam，Cambridge，MA，USA)和CD105 (Abcam)的抗体，同时也平行检查CD34阳性细胞(补充图S1A).用没有初级抗体的封闭缓冲液孵育的细胞用作阴性对照。共有10，000个事件用BD Facscato II(Becton Dickinson和公司)进行了评估，并使用FlowJo软件(版本10 . 6 . 1；Treestar，Ashland，OR，USA)。

2.4.总基因提取和定量逆转录聚合酶链反应分析

按照制造商的说明，使用RNA微型试剂盒(美国加州巴伦西亚Qiagen)获得所有干细胞、分期肝分化诱导细胞和分离的人原代肝细胞(PHH)的总RNA。对于肝组织，制备了大约40-50毫克的组织，并使用喹唑啉裂解溶液从样品中提取基因(喹唑啉)。互补的脱氧核糖核酸(cDNA)是使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix合成的(日本大阪东洋市)，qRT-PCR是使用CFX Connect实时聚合酶链反应检测系统(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad实验室)用5×HOT FirePol EvaGreen QPcR Supermix(爱沙尼亚塔尔图索利斯BioDyne)进行的。样品在95℃变性15分钟，然后在95℃变性15秒，在60℃退火20秒，在72℃延伸20秒。使用Bio-Rad CFX Maestro软件(CFX Maestro 1.1版)自动确定循环阈值和相对标准化表达；Bio-Rad实验室)。用熔融曲线分析测量特异性扩增。基于δ-δCt方法计算相对表达值，并归一化为磷酸甘油醛脱氢酶表情。引物序列在表2和补充表格S1。

2.5.混合淋巴细胞反应试验

对于单向MLR试验，从2名不同的健康志愿者(献血者1: 36岁女性，亚洲人；献血者2: 29岁女性，亚洲人)通过密度梯度离心法，使用菲科尔-帕克PLUS(通用电气医疗保健公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。用10微克/毫升丝裂霉素C(西格玛·奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)溶液处理一批多溴联苯俱乐部，制备刺激细胞。1小时后，用补充有10%胎牛血清的RPMI 1640(Hyclon)洗涤细胞至少3次。自体或同种异体骨髓基质干细胞检测是通过在96孔平底培养皿(康宁公司-生命科学，美国北卡罗来纳州达勒姆)(1.0 × 105细胞/孔)。细胞在37℃下用5%一氧化碳孵育2九天。为了测量干细胞对免疫细胞增殖的影响，将人骨髓间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞传代、计数、接种，并与人骨髓间充质干细胞(1.0 × 105细胞/孔)96小时。为了测量增殖指数，根据制造商的说明，使用生存力测定试剂盒(韩国首尔医疗中心)对活细胞进行计数。简而言之，在加入干细胞之前和与干细胞共培养96小时之后，向每个孔中加入细胞存活溶液。孵育2小时后，在450纳米的波长下测量光密度。增殖指数通过将96小时后培养细胞的平均光密度值除以加入干细胞前细胞的平均光密度值来计算(n = 4)。

2.6.免疫荧光测定

细胞在分化0、7、14和21天后用4%甲醛固定。洗涤、透化、封闭固定的细胞，并用白蛋白(1∶100；桑塔克鲁兹生物技术公司，达拉斯，德克萨斯州，美国)抗体在4℃过夜。山羊抗小鼠IgG FITC结合的二级抗体(1:100；桑塔克鲁兹生物技术公司)被用来检测信号。细胞核用4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)固定液(Abcam)染色。荧光信号用荧光显微镜(AxioObserver Z1卡尔·蔡司，奥伯科钦，德国)。

2.7.干细胞的体外肝分化

肝细胞分化的2步分化方案是从以前报道的骨髓间充质干细胞肝源性分化方案简单修改而来的[19].简而言之，每种干细胞类型被接种在25厘米2测试瓶(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热费希尔科学公司)，保存在DMEM/F12(1:1；补充10纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子，1%非必需氨基酸(NEAA；100微克/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素和10%胎牛血清，温度为37℃，含5%一氧化碳2在潮湿的培养箱里。2天后，将细胞与步骤1培养基一起孵育，该培养基由伊斯科夫氏改良的杜尔贝科氏培养基(IMDM；Gibco)补充20纳克/毫升HGF (Peprotech)，10纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子，0.61毫克/毫升烟酰胺(Sigma Aldrich)7天。两个小分子，5-氮杂胞苷的2微米(西格玛·奥尔德里奇)和法舒地尔-盐酸的10微米(阿多克生物科学公司，加利福尼亚州欧文，美国)在步骤1的分化过程中被加入。对于肝脏成熟，将培养基改为第2步培养基，包括添加20纳克/毫升制瘤素M (R&D系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯市，美国)的IMDM，1%微米地塞米松(西格玛·奥尔德里奇)和50纳克/毫升胰岛素-转铁蛋白-硒；Gibco)最多21天。每隔一天更换所有培养基，显微镜下监测形态学变化(奥林巴斯IX73奥林巴斯，东京，日本)。

2.8.线粒体功能测定(海马测定)

线粒体呼吸功能使用XF细胞有丝分裂压力测试试剂盒在XF24细胞外流量分析仪(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉，美国)中进行测量。在线粒体耗氧率测量之前，将第0天和第7天的所有细胞接种在明胶包被的XFe24细胞培养板上(安捷伦科技公司)。由于很难从最初培养的平板上分离第14天的细胞，从第一天开始，所有第14天的肝细胞样细胞都在明胶包被的XFe24细胞培养平板上分化。通过连续加入寡霉素(1.5微米)、羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯基腙(FCCP；1微米)，抗霉素A (0.5微米)和鱼藤酮(0.5微米)。三磷酸腺苷产量、最大呼吸、反向能力和非线粒体氧利用率通过前述方法计算44].这些值被标准化为基线耗氧量和细胞DNA量。

2.9.体内干细胞治疗肝损伤模型

在所有体内实验中，hLD-SC 1和hLD-SC 2被用作代表性的hLD-SCs。为了测量干细胞的短期转运，使用了肝脏缺血-再灌注损伤(LIRI)小鼠模型。雄性8周龄C57BL/6J小鼠购自Joongah Bio(韩国京畿道)。为了诱导部分肝脏缺血，使用一个11毫米长的微夹钳(类别号00398-02；精细科学工具，德国海德堡)阻断门静脉45分钟后释放。移除夹子后，用1.0 × 106通过尾静脉注射细胞，然后再灌注6小时为了测量干细胞在体内的自发分化，8周大的免疫缺陷Rag2-/-Il2rg-/-(NRG)小鼠购自Joongah Bio。为了诱导急性肝衰竭，向小鼠腹腔注射肝毒性化学品硫代乙酰胺(TAA；80毫克/千克)在5天内分两次服用。在第5天，小鼠经脾内途径(1.0 × 10)进行肝分化0、7和14天后，用hUC-MSCs以及hLD-SC 1或hLD-SC 2细胞进行处理6每只小鼠的细胞)。所有小鼠在细胞移植后允许恢复14天。所有动物实验均按照ILAR实验动物资源研究所的相关指南和规定进行。本研究方案由Asan医学中心Asan生命科学研究所机构动物护理和使用委员会(IACUC)审查和批准(授权号2018-12-167)。

2.10.DiR细胞标记和体内荧光成像

共1.0 × 106细胞用异种光标记(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)。染色程序按照制造商的说明进行。简而言之，细胞在37℃下用DiR处理30分钟，在400 ×下离心3分钟g室温下，用PBS洗涤两次。在所有情况下，DiR标记的细胞悬浮在盐水中，然后在标记后2小时内通过尾静脉静脉注射。在拍摄荧光图像之前，去除C57BL/6小鼠的毛发以避免在检测荧光信号时的任何干扰。在注射后1、2、4和6小时，使用色诺根IVIS光谱系统获得荧光图像。所有图像都是在748纳米激发和780纳米发射下获得的。

2.11.血清测量分析

从小鼠的下腔静脉获得全血样品，并在血清分离管(SSTs贝克顿·迪金森公司)。不锈钢管在室温(22±2℃)下孵育30分钟，并以2500×离心g在4℃保持20分钟。收集上清液并作为血清样品储存。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平由日立7180自动分析仪(日本东京)分析。

2.12.小鼠肝脏中人基因的检测

为了测量用人干细胞处理的小鼠中剩余的人细胞，使用聚合酶链反应检测人特异性线粒体DNA (mtDNA)和人特异性基因组DNA (gDNA)。从福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本中提取总DNA。使用切片机切割固定样品，用二甲苯脱蜡，用无水乙醇洗涤，然后使用FavorPrep组织基因组DNA提取迷你试剂盒(类别号FATGK 001-2；Favorgen，屏东，台湾)。对于阳性人类样本，市售的正常肝细胞系HeParg(1×105细胞；类别号HPRGC10Gibco)，并根据相同的方法提取总DNA。小鼠基因组磷酸甘油醛脱氢酶被用作内部控制。引物序列列于表2。

2.13.组织学分析和免疫组织化学

肝组织被切除，固定在4%福尔马林中，并包埋在石蜡中。石蜡块用切片机切片，产生4个微米厚的切片。为了评估肝损伤的严重程度，采用铃木法对H&E染色的载玻片进行评分，并根据3名病理学家(表3；分数范围，0–4)[45].对于免疫组织化学(IHC)，切片在二甲苯中脱蜡，使用乙醇梯度再水合，在10毫米柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸20分钟以回收抗原，然后用0.3%甲醇中的过氧化氢处理以去除内源性过氧化物酶。Vectastain精英ABC HRP套件(类别号PK-7200；矢量实验室，伯林盖姆，加利福尼亚州，美国)是根据制造商的说明使用的。stem 121(1:1000；类别号Y40410Takara Bio Inc，Kusatsu，Shiga，日本)和白蛋白抗体(1:200；猫号sc-271605，桑塔克鲁兹生物技术公司)在Dako REAL抗体稀释液(猫号s 202230-2；安捷伦科技公司)，并在4℃孵育过夜。安捷伦科技公司)根据制造商的说明使用。切片用QS苏木精复染(载体实验室)并用载体计数仪(载体实验室)固定。组织学图像通过使用照相机的光学显微镜获得(奥林巴斯DP27奥林巴斯，梅尔维尔，纽约，美国)。在放大100倍的图像中，用图像分析软件(NIH)测量阳性染色面积。

2.14.统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行。组织学评分以中位数和范围表示。所有其他数据以平均标准偏差(SD)表示。使用单向或双向方差分析(ANOVA)进行3个或更多比较集的统计分析，随后使用Bonferroni的多重比较测试，并使用学生的t检验进行两组比较。P%3C 0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1.hLD-SCs的表征

从形态学上看，培养的hLD-SCs呈纺锤形，细胞核呈卵圆形(图1a)。我们观察到hBM-MSCs和hUC-MSCs在形态学上的相似性。流式细胞术显示，不仅人骨髓间充质干细胞，而且人骨髓间充质干细胞也表达骨髓间充质干细胞表面标记CD90和CD105，而所有人骨髓间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞的造血干细胞标记CD34(图1b；CD34阳性细胞的数据见补充图S1A).hLD-SCs也表达代表性的干细胞标记，即八聚体结合转录因子4(OCT4),NANOG，和性别决定区域Y -框2(SOX2) (图1c)。与骨髓间充质干细胞相比，骨髓间充质干细胞的表达水平OCT4,NANOG，和SOX2在hUC-MSCs、hLD-SC 1和hLD-SC 3细胞中表达相对较低，而hLD-SC 2细胞表达相对较高。众所周知，骨髓间充质干细胞通过分泌细胞因子参与细胞间的直接接触和细胞间的间接交流，尽管其确切作用尚不完全清楚[46]，因此我们比较了这些细胞中的促炎和抗炎细胞因子。在促炎细胞因子中，肿瘤坏死因子α（肿瘤坏死因子α)与hBM-MSCs相比，hUC-MSCs和所有hLD-SCs的水平明显较低。在人骨髓间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞中，人骨髓间充质干细胞表达水平最低肿瘤坏死因子α和IL1β。然而，IL1β在hUC-MSCs和三种hLD-SCs中相对较高。所有hUC-MSCs和hLD-SCs均表达较高水平的白细胞介素6(IL6)而hLD-SC 2细胞表达最高水平(图1d)。抗炎细胞因子，转化生长因子β1(转化生长因子β1)，而另一种抗炎细胞因子白细胞介素10(IL10)，在hUC-MSCs和两个hLD-SCs中表达相对较高，在hLD-SC 1细胞中表达最高。的表达IL10在hLD-SC 3细胞中最低(图1e)。细胞因子表达不一致的原因尚不清楚，但可能是由于肝脏供体的多样性导致了差异。众所周知，细胞因子的表达因年龄、性别和疾病经历而异[47].在三个hLD-SCs中，hLD-SC 1来自一名21岁的男性，表达的HLd-Sc 1相对较高。肿瘤坏死因子α,IL1β，和IL10。hLD-SC 2的供体是一名38岁的女性，在三名肝脏供体中，38岁供体血清中的甘油三酯(TAG)含量相对较高(157 mg/dl)，但没有超过正常范围。hLD-SC 2细胞表达最高水平的多能性标记IL6。hLD-SC 3细胞分离自一名血清总胆固醇(235 mg/dl)和高密度脂蛋白(HDL)-胆固醇(90 mg/dl)升高的27岁女性。hLD-SC 3细胞表达相对少量的。肿瘤坏死因子α,IL1β,转化生长因子β1，和IL10。虽然没有足够的病例来概括供肝者和获得的hLD-SCs之间的关系，但根据我们的证据，供肝者的健康状况似乎与获得的hLD-SCs有关。由于间充质干细胞抑制免疫细胞增殖[48】，我们测试了hLD-SCs是否可能具有类似的免疫调节能力。为了诱导免疫细胞增殖，从两个同种异体个体获得的外周血单个核细胞被共培养。在倒置显微镜下观察用每种类型的干细胞处理后的同种异体反应和免疫细胞增殖的抑制(图1f)。与自体免疫细胞增殖率相比，同种异体外周血单个核细胞表现出显著的(p%3C 0.001)扩散。这种增殖显著(p%3C 0.001)在用血红蛋白-骨髓间充质干细胞、人绒毛膜促性腺激素-骨髓间充质干细胞或所有三种人绒毛膜促性腺激素-骨髓间充质干细胞(图1g)。这些结果表明hLD-SCs具有免疫抑制作用，这是间充质干细胞的重要生理功能。

3.2.改良的两步肝分化方案从hLD-SCs产生肝细胞样细胞

以前的一项研究报道了一种两步方法，用化合物，包括HGF，碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺，将骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞19].在目前的研究中，我们测试了几种不同化学物质的混合物，并通过添加法舒地尔(RhoA/ROCK信号抑制剂)和5-氮杂胞苷(DNMT抑制剂)来提高分化能力，从而修改了以前的两步肝细胞分化方案(图2a)。为了测量我们的分化方案的适用性，跟踪了细胞的形态学变化。在第一步分化过程中，形态学变化不明显。然而，在改用第二步鸡尾酒后7天，细胞开始变得更圆。在步骤2培养基中维持细胞7天以上后，细胞显示出向肝细胞样形态的强烈变化(图2b)。

3.3.肝谱系发育过程中基因表达模式的比较

由于我们的两步体外分化方案显示了干细胞的肝细胞样形态学变化，我们在分化过程中使用分子动力学来跟踪这些变化。众所周知，干细胞经历了向肝细胞样细胞的阶段性分化，即从多能细胞分化为最终的内胚层、肝祖细胞，最后是成熟的肝细胞样细胞49,50].目前的研究跟踪了肝谱系发育期间代表性阶段指示基因的变化(图3a)。由于我们可以观察到细胞形态的明显变化，我们接下来分析了作为肝细胞成熟标志的人白蛋白的抗体表达。白蛋白的蛋白表达在第7天不明显。然而，细胞在第14天开始表达白蛋白，并且这种表达增加到第21天(图3b)。对于基因表达分析，将分期肝分化相关基因的表达值与原代人肝细胞的表达水平进行比较。首先，测量三个内胚层阶段标记(图3c)。有趣的是，hLD-SCs表达高水平的GATA4，内胚层发育的一个重要基因。的基础表达水平GATA4在hLD-SCs中的表达水平高于PHH地区，尽管GATA4在肝分化过程中，hLD-SCs的表达降低。叉头盒蛋白A1(FOXA1)在hLD-SCs的干细胞阶段表达相对较高，但这种差异在第7天消失。FOXA2在第0天，人骨髓间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞的表达没有差异，但在第14天，人骨髓间充质干细胞的表达显著增加。然而，表达水平FOXA2与第0天相比，第14天的hLD-SCs相对较高，但差异不显著(图3c)。值得注意的是，所有分化的人骨髓间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞不能达到的表达水平FOXA1和FOXA2在肝分化过程中。考虑到已有报道称PHHs在胚胎发育和成年期自然表达FOXA1/2，[51]，这可能是由于天然产生的肝细胞和体外分化的肝细胞样细胞之间的差异造成的。目前，肝祖细胞是[最广泛接受的治疗肝病的有希望的再生来源52].因此，我们相应地测量了肝祖细胞相关基因[的表达50].羧肽酶M(每千成本（cost per mille）)已知在胚胎肝祖细胞[中高度表达53].CD133据报道主要在癌症干细胞中表达[54]，但也被广泛接受为肝祖细胞标记物[55].肝祖细胞标记物，每千成本（cost per mille）和CD133，在第14天在hLD-SCs中显著增加，但在hUC-MSCs中不显著增加(图3d)。然而，hUC-MSCs和hLD-SCs不表达上皮细胞粘附分子(分子)在肝分化期间(补充数字S2A).分子已被报道为肝祖细胞的标志，同时已知其在细胞增殖和分化中具有多种作用[56]，但成熟肝细胞不表达分子[57].此外，最近的一项研究报告称分子表达可抑制体外[肝成熟58].在以下细胞角蛋白19的测量中(CK19)，这是肝祖细胞和胆管分化的指示性标志，只有未分化的hUM-MSCs表达相对较高CK19，在分化过程中减少(补充图S2B).这一观察结果与以前的报告一致，以前的报告指出未分化的人脐带间充质干细胞可以表达CK19[扩张期间18]而hLD-SCs不表达CK19[32].另一种已知的肝祖细胞标记物，SRY相关的HMG盒转录因子9(SOX9)，在所有hUC-MSCs和两个hLD-SCs的分化的第14天增加，而hLD-SC 1细胞达到其最高水平。的表达SOX9在第21天hLD-SC 1和hLD-SC 2细胞中迅速减少，但是在第21天hUC-MSC细胞保持在升高的水平(补充数字S2C).SOX9是广泛接受的胆管细胞分化标志。然而，SOX9-表达细胞被认为在激活肝祖细胞成熟为肝细胞[中起重要作用59].对这些结果进行综合解释后，分子和CK19可能对当前的体外肝分化结果影响不大每千成本（cost per mille）,CD133，和SOX9可以作为hLD-SCs肝分化的指示标记。肝细胞成熟标记物在分化过程中逐渐增加图3e)。对于HNF1A和细胞色素P450 1A2(CYP1A2)，尽管hLD-SCs在分化过程中持续上升，但hUC-MSCs的表达最高。对于HNF4A，hLD-SCs在第14天表达增加，这种趋势在hUC-MSCs中不存在。对于甲胎蛋白(法新社(Agence France Presse)),白圣职衣、和细胞色素P450 3A4(CYP3A4)，hLD-SC 1细胞在分化过程中表现出与hUC-MSCs相似的表达模式。然而，CYP3A4肝分化过程中hLD-SC 2细胞的数量没有增加。总的来说，hLD-SCs具有肝源性潜能，内胚层标记物基础表达高，GATA4和FOXA1。两步肝脏分化似乎在第14天成熟中期，肝脏祖细胞相关基因水平较高，每千成本（cost per mille）和CD133。肝分化期间，hLD-SCs显示肝细胞成熟相关标志物持续升高。然而，至少在体外，hLD-SCs与hUC-MSCs相比，在肝脏成熟方面没有优势。

3.4.线粒体耗氧率和代谢谱比较

由于分化过程需要高能量消耗，最近的研究表明线粒体功能在分化过程中很重要，如成骨分化[60]和脂肪生成[61].光学字符识别是一种通过线粒体氧化磷酸化来测量三磷酸腺苷产量的有效方法。因此，我们比较了两步肝分化过程中的线粒体光学字符识别。对于hUC-MSCs和两个hLD-SCs，在分化的第7天OCR增加。就代谢谱而言，最大呼吸和备用呼吸能力在分化的第7天显著增加(图4a)。在分化的第0天，hUC-MSCs和两个hLD-SCs具有相似的光学字符识别率。在两个hLD-SCs中，基础呼吸和ATP产量稍低。然而，在分化的第7天和第14天，两个hLD-SCs的光合作用，尤其是最大呼吸作用相对较高(图4b)。综上所述，这些结果表明，当hUC-MSCs和hLD-SCs未分化时，线粒体功能相似，但当细胞经历肝分化时，hLD-SCs往往表现出更有利的能量状态。由于我们补充了两种小分子，法舒地尔和5-氮杂胞苷，以增加前7天的分化稳定性，这可能是分化第7天光学字符识别率增加的原因。然而，hLD-SCs中OCR的增加似乎与肝分化结果无关，特别是考虑到大多数肝细胞成熟标记物(HFN1A,法新社(Agence France Presse)、和CYP家族基因)在分化诱导的hLD-SCs中相对较低。

3.5.肝缺血-再灌注损伤期间肝干细胞的转运(LIRI)

众所周知，间充质干细胞通过其营养性质引起肝脏再生，并能保护肝脏免受损伤[17].除了这些因素外，据报道外源性间充质干细胞可转移至损伤器官[62].由于我们的体外研究显示hLD-SCs具有类似于MSC的特征，我们想知道在体内还能观察到什么特征。为了测量细胞转运事件，小鼠暴露于肝脏缺血45分钟，然后通过尾静脉静脉注射每种类型的hUC-MSC或hLD-SCs，然后再灌注6小时(图5a)。与未治疗的LIRI组相比，用人骨髓间充质干细胞或两种人骨髓间充质干细胞治疗的小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平较低(图5b)。由于细胞用DiR荧光染料标记，我们可以使用IVIS光谱成像系统测量细胞的运输。通过尾静脉将细胞注射到小鼠体内后，hUC-MSCs比hLD-SCs更早沉降。人脐带间充质干细胞的荧光信号密度较高。这可能是因为hUC-MSCs和hLD-SCs的大小不同。腹部切开和组织提取的代表性图像显示，通过尾静脉注射的干细胞在6 h后被输送到肝脏(图5c)。组织学也显示了一致的结果，例如人骨髓间充质干细胞和两种人骨髓间充质干细胞具有相似的降低LIRI效应(图5d，E)。炎症细胞因子的基因水平，肿瘤坏死因子,Il1b,Il6，和Il10在未移植的LIRI组中均显著增加，而干细胞治疗显著减弱了这种增加(图5f)。

3.6.分化诱导的hLD-SCs的自发分化和再生潜能

我们以前的体外研究表明hLD-SCs与hUC-MSCs具有不同的特征，具有高的基础内胚层标记表达(GATA4和FOXA1)和高肝祖细胞相关基因表达(每千成本（cost per mille）和CD133)，尽管没有认识到肝细胞成熟相关标志物的优势。基于这些观察，我们想知道hLD-SCs在体外分化的不同阶段转移到体内环境后是否显示出不同的结果。为了观察hLD-SCs的体内反应，免疫缺陷型NRG小鼠用肝毒性TAA治疗两次，共治疗5天，然后通过脾内途径移植hUC-MSCs或hLD-SCs。让小鼠恢复14天(图6a)。第5天的小鼠表现出大范围的坏死细胞死亡，并表现出典型的肝衰竭症状，但大多数在14天后恢复(补充图S3A).血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的升高在第14天也恢复了(补充图S3B).在移植小鼠的人骨髓间充质干细胞或人骨髓间充质干细胞中观察到相同的结果(补充图S3C)血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶无明显变化(补充图S3D).我们可以通过测量人类特异性线粒体DNA (mtDNA)和基因组DNA (gDNA)扩增子(图6b)。移植肝分化诱导细胞的小鼠肝脏中mtDNA和胶质细胞源性神经营养因子的相对含量显著高于未分化干细胞(图6c)。正如我们之前的体内模型所显示的，当损伤发生时，hUC-MSCs和hLD-SCs转运到肝脏中，人gDNA和mtDNA在受损肝脏中的存在是相当合理的。为了测量肝脏中是否发生自发分化和成熟为功能性肝细胞，使用人类细胞特异性细胞质标记物STEM121检测人类细胞，并使用IHC检测人类白蛋白(hALB)作为人类肝细胞标记物。在所有进行细胞移植的小鼠中观察到人细胞和表达hALB的细胞(图6d和补充图S4A).我们发现并非所有残留在小鼠肝脏中的人类细胞都表达hALB(图6e和补充数字S4B).在hUC-MSCs和hLD-SC 1移植的小鼠中，14天的分化细胞显示出葡萄状的hALB阳性区域的高级成熟。特别是，14天分化的hLD-SC 1细胞、人细胞质标记阳性细胞和hALB阳性细胞大多位于肝内胆管(也称为海林管)附近。在hLD-SC 2细胞移植的小鼠中，在导管区域周围观察到细胞质标记阳性细胞，但是与hLD-SC 1细胞相比，观察到较少数量的hALB阳性细胞。由于hLD-SC 2细胞的体外肝分化表现出相对较小的变化，尤其是在肝细胞成熟相关标记物方面，这些体内结果相当一致。综合考虑结果，hLD-SCs似乎对肝脏友好，这使得它们能够更好地适应体内环境。虽然hLD-SCs的体外分化在肝细胞成熟相关标记物的产生方面是不完全的，但当移植到体外环境中时，它们自发分化为成熟肝细胞。值得注意的是，当体内细胞移植与体外肝分化相结合时，hLD-SCs比hUC-MSCs产生成熟肝细胞的速度更快。

4.讨论

hLD-SCs被评估为肝脏再生治疗的可能来源。然而，问题仍然是来自肝脏的成体干细胞是否能比其他干细胞更好地向肝谱系分化。在目前的研究中，我们通过比较与分期肝分化相关的基因和代表线粒体呼吸的OCR，直接比较了肝分化过程中hLD-SCs和其他类型成体干细胞的差异。最后，我们将肝分化诱导的hLD-SCs移植到两种不同的肝损伤小鼠模型中。我们从三个不同的肝脏捐献者中分离出了hLD-SCs，使用的方法与Herrera [先前报道的方法相似29]和纳吉米·[来源：“泽平科技”公众号24h在线答疑