图1. 根窗示意图
三、反应
1.将聚酰胺膜裁剪成与根窗相同的尺寸，转移适量 (可刚好饱和浸润聚酰胺膜，约2 ml/10×10 cm2) 酶底物溶液至灭菌试管中，试管尺寸由膜的尺寸确定。将聚酰胺膜卷成蛋卷状，垂直放入试管，用封口膜封口，水平放置试管在试验台上，沿相同方向滚动20-30次，保证酶底物均匀分布在聚酰胺膜。
2.将根盒根窗面向上水平放置，小心打开根窗，整个过程应均匀用力，保持根土界面的完整性。
3.用镊子从试管中取出聚酰胺膜，展开后平整贴在根土界面上，避免气泡产生，快速将事先剪好的铝箔纸平整覆盖在膜上，铝箔纸比膜稍大，以完全遮蔽光线，以防酶促反应产生的荧光基团被紫外淬灭。在铝箔纸上覆盖海绵薄膜或者草纸 (3-4张并折叠为膜相当大小)，保证盖子与膜之间空隙被完全填充，然后盖好根窗，然后保持根窗面向上水平放置培养1 h。培养时可用重物压紧根窗，保证土样与膜紧密接触且各部位受力均匀。
四、成像
打开根窗，依次移除填充层和铝箔纸，自上而下取下聚酰胺膜，用软刷移除膜上附着的土壤颗粒等杂质，避光条件下快速转移到暗室中，置于350 nm的紫外灯下，采用蝴蝶光源或面光源保证整张膜受光均匀，调整好相机参数和与膜的相对位置 (整个实验过程要保持相机状态一致)，在膜的一侧平行放置刻度尺，拍摄照片。为排除环境反射光干扰，可在镜头上安装中心波长为460 nm的带通滤光片。、
五、标准品成像
取面积为2×2 cm2的聚酰胺膜，分别在不同浓度的MUF或AMC溶液中饱和浸润，同时记录完全浸润此聚酰胺膜所需的溶液体积，在与样品酶谱同样的条件下进行成像，用于后续标准曲线绘制。
二、土壤团聚体表面酶活原位分布
材料与试剂
1.套筛
2.菲林胶片
3.硅基片
4.SU-8光刻胶
5.聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯 (PEGMEA)
6.异丙醇
7.PDMS预聚体
8.PDMS固化剂
9.载玻片
10.毛细吸管
11.培养皿
12.吗啡啉乙磺酸半钠盐MES (C6H13NO4SNa0.5)，相对分子质量206.73 g/mol
13.TRIZMA-Base，相对分子质量121.14 g/mol
14.TRIZMA-HCl，相对分子质量157.60 g/mol
15.4-甲基伞形酮 (MUF)，相对分子质量176.17 g/mol
16.7-氨基-4-甲基香豆素 (AMC)，相对分子质量175.18 g/mol
17.带MUF或AMC标记的酶底物
仪器设备
1.紫外深度光刻机 (URE-2000/25L型，上海光学机械厂)
2.数控热平板
3.匀胶机
4.真空泵
5.烘箱
6.激光共聚焦显微镜
实验步骤
一、缓冲液配置
1.100 mM MES储备液 (用于配置MUF标记的底物)：称取2.0673 g，转移至烧杯，加入适量灭菌水，用玻璃棒搅拌，转移至100 ml容量瓶，用灭菌水定容至100 ml；
2.100 mM TRIZMA储备液 (用于配置AMC标记的底物)：称取1.2114 g TRIZ-Base &1.5760 g TRIZ-HCl转移至烧杯，加入适量灭菌水，用玻璃棒搅拌，转移至100 ml容量瓶，用灭菌水定容至100 ml；配置完成后转移至广口瓶并于4 °C保存。
注：储备液可在于4 °C储存2个月。
二、酶底物配置
不同的酶在不同土壤条件最适酶底物浓度存在差异，通常为1 mM~10 mM。为节约试剂，同时达到最佳实验效果，建议通过预实验确定底物浓度。下面以配置100 ml 10 mM的β-D-glucosidase举例：
用5 ml移液枪吸取100 mM的MES缓冲液储备液，用灭菌水稀释成10 mM缓冲液工作液待用。称取4-MUF-β-1,4-D-glucoside 338.31 mg，转移至烧杯，加适量MES缓冲液工作液，用玻璃棒搅拌溶解 (也可以通过涡旋、水浴加热使其溶解，水浴温度应低于60 °C)，用MES缓冲液工作液定容至100ml。
三、团聚体微反应室制作[3]
1.掩膜制作
使用 Auto CAD 软件设计实验所需图案，此处以直径为 2 mm、间隔为 0.5 mm 的 3 × 3 圆形微阵列为例，通过 25400 dpi高分辨率激光打印机打印在菲林胶片上，制成掩膜，一张掩膜可打印多个微阵列，从而实现微反应室的高通量制作 (图2)。掩膜中灰色区域为透光区域，而其余黑色部分为不透光区域。
图3. 几何校正示意图
具体办法：打开ACDSee Pro，在编辑状态下打开“透视校正”功能，选择显示网络线，拖动网络线外边框的一个角向外拖动，直到线条垂直。
注：也可根据自己熟悉的操作，使用Photoshop或Image J等软件进行几何校正。但这种调节均是有损调节，会导致图像信息的损失，建议尽量在拍摄过程中保持镜头与膜的平行，避免形变。
二、灰度校正及伪彩化
图像在成像过程中，往往由于光照、摄像、传感器灵敏度以及光学系统等的不均匀性而引起图像某些部分较暗或较亮。对这类图像使用灰度级修正，能够获得满意的视觉效果。针对酶谱图片，在相机设置和位置不改变的情况下，主要是检查图片背景是否一致，可用刻度尺作为背景参考。曝光强弱不同会缩小或扩大同一实验中处理间的差异。具体办法 (之后均以Image J为例)：Image-Type-8 bit；之后选择任意背景区域，进行分析，查看Analyze-Measure的结果。如果不一致，则需要根据Process-Math-Add/Subtract命令来做小幅度调整。选择膜所在范围后，Image-Crop/Duplicate，将膜以外的视野去掉。
上伪彩：由于人眼分辨率不同彩色的能力比分辨不同灰度级的能力强，因此可以将人眼难以分辨的灰度变化施以不同的色彩来提高识别率。具体步骤：Image-Lookup tables-选择适合自己的结果的样式。调整图片到最佳显示状态：Image-Adjust-Brightness/Contrast-Auto/Set.
结果如下图所示：
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来源：刘永鑫Adam
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