文章目录
- 1. 细胞增殖的定义
- 2. 检测细胞数量：CCK-8 法
- 3. 检测细胞增殖：BrdU 掺入法
- 4. 检测细胞增殖：平板克隆
1. 细胞增殖的定义
- 适用于检测贴壁细胞和悬浮细胞数量
- 不能检测组织中的细胞数量
- 不能确认细胞数量的变化是由细胞增殖增多还是细胞凋亡减少引起的，需要配合其他实验结果进行综合判断
(2) CCK-8 测细胞增殖操作流程
★ 预实验：做几个孔，摸索接种细胞的数量 和 加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
- 接种细胞数量：CCK-8 至少要测 5 天，因此接种的细胞量要保证长到第五天时，细胞不能长得太满。
- 培养时间：根据细胞种类不同、每孔细胞数量多少来定。如，白细胞难显色，因此要培养时间较长或要增加细胞数量；悬浮细胞相对于贴壁细胞更难显色，加入 CCK-8 1-4h 后用肉眼看下显色程度，或用酶标仪检测，如果显色困难，就将培养板再放回培养箱继续培养数小时；贴壁细胞培养 30min 就可以取出来看显色程度。CCK-8 最佳反应时间是以具体显色的最佳时间为准。
★ 正式实验：
① 制备细胞悬液铺 96 孔板。
- 贴壁细胞要消化充分（可以稍过一点点），这样不需要用力吹打就可以让细胞分散得很好；如果消化不完全，就要用枪用力吹打，使细胞受到机械损伤，影响实验结果。
- 消化后要做细胞计数，调整到合适的密度（预实验摸索到的细胞接种量）。
-
铺 96 孔板：
△ 要铺均匀，先在每孔中加 50ul 完全培养基（可以在孔中形成液体的表面张力，使后面接种的细胞分散开），再向各孔加 50ul 细胞悬液。这里相当于把细胞稀释了 1 倍，因此前面调整细胞密度时要把细胞密度加倍。
△ 铺板时注意不时地混匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下，保持细胞悬液随时都是均匀状态，尽量保证加到每个孔中的细胞数量都是一致的。
△ 96 孔板周围一圈孔不加细胞，而是加满 PBS，因为周围孔在培养箱中持续培养的过程中容易蒸发，不适合铺细胞，加 PBS 可以保护被围在中间的孔。
△ 铺完板后，轻敲板底或用振荡器摇板，帮助细胞分散。
② 37℃培养箱中培养。 转移 96 孔板时，注意尽量端平端稳，一般状态好的细胞 2h 就能贴壁。
③ 加 CCK-8 试剂 10μl/well。细胞贴壁后，加 CCK-8 采集 0 点的数据。
- 使用新鲜的完全培养基稀释 CCK-8（），完全混匀，把带测控中旧的培养基吸出，每孔加入 100-110ul 新配好的含 CCK-8 的培养基（保证每孔加样量一致即可，这样做可以避免直接加 10ul CCK-8 引起的加样误差）。
- 加液时，注意沿着孔壁慢慢加，尽量避免出现气泡（影响酶标仪读数），如果有气泡也不用着急，可能再培养之后气泡就消失了。
- 配 CCK-8 时，多配 1-2 份（看做了多少板）含 CCK-8 的培养基，加入同一块板的空孔作为调零孔（如果细胞培养时含药物，调零孔也要加药物，只是不加细胞）；如果一次测多块板，每块板都要加调零孔。
④ 继续培养数小时（具体时间是预实验摸索好的）。肉眼看到培养基变成橙色，培养时间越长，橙色越深。
⑤ 测定 450nm 处 OD 值。
- 培养到合适时间，上酶标仪检测 OD 值，OD 值控制在 0.2-1，1 左右较好。
- 建议用双波长检测，检测波长 450nm、参比波长 600-650nm 两个波长各检测一遍，参比波长可以过滤掉因为液体浑浊、孔板底不干净带来的测量误差。
- 建议检测时间定点。每天在同一个时间点检测，这样每两次检测时间间隔相同，有助于得到更准确的数据。
- 周围一圈加满无菌 PBS，中间粉色区域铺细胞
-
分三组，每组至少 3 个复孔：
◆ 空白对照：不做任何处理的细胞
◆ 阴性对照：如，转染了对照质粒的细胞
◆ 实验组：如，转染了过表达质粒的细胞 - 中间最后一列留作调零孔，从上到下刚好 6 个孔，测 5 天，每天一个孔。
- 酶标仪测 OD 值时，要取下 96 孔板的盖子，迅速测完，细胞不会污染。
- 也可以提前规划好，把同一个时间点的细胞铺在同一块板上，测一块丢一块。
(4) CCK-8 数据处理与绘图
例如：检测波长 450nm，参比波长 600nm。
- 第一步：x = OD450nm－OD600nm。（计算每孔的△OD，调零孔也要计算）
- 第二步：y = x – △OD调零孔。每孔的△OD 减去调零孔的△OD，如果所用的仪器可以自动调零，跳过这一步计算。
- 第三步：复孔求平均值。
- 第四步：将独立重复 3 次的数据导入 graphpad prizm 画折线图。
-
如果需要测定细胞的具体数量（想知道细胞每天涨了多少个），需要建一个标准曲线。
细胞计数 → 等比稀释细胞，建立 5-8 个梯度，3 复孔/梯度 → 37℃培养箱中培养 → 加 CCK-8 试剂继续培养细胞 → 测定 OD 值 → 制作标曲，x 轴为细胞数量，y 轴为 OD 值。
3. 检测细胞增殖：BrdU 掺入法
细胞周期
-
细胞周期分为间期和分裂期，间期包括 G1 期、S 期、G2 期。
△ ：DNA 合成前期，合成 RNA 和蛋白质，为 DNA 复制做准备；
△ ：DNA 合成期，DNA 复制，合成组蛋白与 DNA 形成染色质，合成 DNA 复制所需的酶；
△ ：DNA 合成后期，DNA 合成终止，合成 RNA 和蛋白质，为有丝分裂做准备。
△ ：细胞分裂期。
BrdU 掺入法测细胞增殖操作流程
数据处理与绘图
（1）拍照
- 拍照时，每张片子随机拍摄 3 个视野，放大倍数以方便细胞计数为宜，比如 。
- DAPI 染色（染细胞核，代表总细胞数）和 BrdU 染色（染正在增殖的细胞）的照片都要拍，同时注意保存 DAPI 和 BrdU merge 的照片。
（2）数据处理
- 第一步：计数 DAPI 阳性的细胞数；
- 第二步：计数 BrdU 阳性的细胞数；
- 第三步：将同视野下 细胞数 / 细胞数 × 100%，得到 BrdU 阳性细胞数的占比；
- 第四步：将同张片子上 3 个视野的 BrdU 阳性细胞数百分比求平均值， 依次将所有片子分析完；
- 第五步：将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。
● 细胞计数的方法：
【ImageJ 图像处理】6. 自动细胞计数
4. 检测细胞增殖：平板克隆
数据处理与绘图
- 拍照时，使用（带白光模式，底部带补光板的）成像仪或相机拍摄整个皿。
- 将平皿倒置，用带网格的透明胶片叠在培养皿上（或者用记号笔在培养皿盖上画网格，盖子翻过来，把皿叠在盖子上，主要是防止漏计数），肉眼计数（先用低倍镜观察大于 50 个细胞的克隆用肉眼看大致有多大，再用肉眼计数），或在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数，或者拍照后用软件计数。
- 计算公式：克隆形成率= 克 隆 数 接 种 细 胞 数 frac {克隆数} {接种细胞数} 接种细胞数克隆数? ×100%
- 将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。
来源：taotaotao7777777
声明：本站部分文章及图片转载于互联网，内容版权归原作者所有，如本站任何资料有侵权请您尽早请联系jinwei@zod.com.cn进行处理,非常感谢！