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原文为自自Microbial association network construction tutorial http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/index.php

简介Introduction

本文提供MENA, LSA, SparCC和 CoNet四种网络构建方法，作者为CoNet作者。由宏基因组公众号翻译整理，并补充及更新部分程序参数。
说明：计算过程在Ubuntu16.04系统的服务器，没服务器的伙伴可以使用QIIME提供的虚拟机；网络可视化在Win10上安装Cytoscape展示及导出。

必须软件Prerequisites

• 最新版Windows版 Cytoscape下载并安装  http://www.cytoscape.org/

• 在Cytoscape的App Manager中安装CoNet和CytoCluster http://systemsbiology.vub.ac.be/conet

• 注册MENA web server: http://129.15.40.240/mena/

• 安装LSA http://hallam.microbiology.ubc.ca/fastLSA/install/index.html

• Spacc安装 https://bitbucket.org/yonatanf/sparcc

• 注册在线微生物管理平台Qiita: microbial study management platform https://qiita.ucsd.edu/ # username: woodcorpse@163.com

• 安装biom: include by QIIME，末安装可先参考安装QIIME

• 安装R包igraph用于可视化SparCC结果

示例数据 Data

Environmental Microbiology 12(11), 2998-3006 (2010).
http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/files.php

MENA

http://129.15.40.240/mena/  自己注册个新用户

• 上传数据：Upload your dataset, arctic_soils_filtered.txt

• 构建网络：Construct the network, 选择数据submit，参数为1，keep blank, do not take alogarithm,其它为默认，Submit

• 查看结果：回主界面，点击Search datasets and networks，每个有项目名、参数和最右边有运行状态，done为完成；点结果列表的名字可看结果，选择不同参数构建网络 Constrcut the netowrk;

• 分析网络：Analyze the networks — Network reports，点击每项按默认参数执行; 如Global Network properties，网络属性，如边、点数据信息；Individual nodes’ centrality为每个点的属性，如node.degree， Clustering.Coefficient；Module Separation and modularity calculation

• 可视化：分析网络中的可视化，可以在线简单成像，也可下载cytoscape格式sif文件及边点注释文件本地分析；并替换所有_为-，替换np为pp，便于后期与Conet比较

• Cytoscapes分析：打开软件

1. 打开网络文件 File — Import — Network — File — arctic 0.540.sif;

2. 打开点属性 File->Import->Table->File — node attribution文件；

3. 布局设置 Layout->yFiles Layouts->Organic;

4. 设置颜色 style,在样式右链下前头中选择 new style,输入名字如“mena”，再设置Fill color的Map选项，Column选择No. module按模块编号上色，Mapping type选择Discrete Mapping，再手动调置每一类的颜色。

5. 导出位图和矢量图；File – Export – Network view as Graph – 分别选择pdf和png保存，png大小为200%,dpi=300；但有时图像尺寸会有问题，需要用AI调整PDF，再输出png或tiff；调整后结果如下：保存至本地。

SparCC

网络接口工具，对数据组成的的鲁棒性更强(0和极大值处理更好)；

相关系数矩阵结果使用R可视化，本地或Rstudio服务器

网络分析 Network analysis

1. 比较Conet与MENA的一致性
   保存Conet为sif格式：File – Export – NetWork – conetNetwork.sif；
   修改其格式与MENA一致便于比较：用Editplus打开conetNetwork.sif，用正则表达式替换tt为tppt；
   使用Cytoscape打开:Import – Network – File打开，
   比较点和边：Tools – Merge – 选择两网络添加至右边，选择Intersect，再点Merge; 看到只有62个点和16条边重合，重合的边极少/p>

2. 全局网络分析 Global network analysis
   Tools->Network Analyzer->Network Analysis->Analyze network，选择默认的无向网络undirected，确定，可获得网络的属性的面板，包括网络参数、密度、样式路径长度和簇系数、节点度分布、节点特异属性(such as 离心率eccentricity and 中介中心性betweenness centrality)

3. 中心节点Hub nodes
   分析后的网络点有很多属性，按degree排序即可找到中心节点，本数据为Acidobacteria。

4. 网络聚类Network clustering
   基因表达网络中，簇用来预测未知功能的基因，与表达相似基因功能相近。微生物相关网络可以发现相似的生活方式。
   先选择正相关的边：从Cytoscape选择，没成功；CoNet输出的为正相关网络，方法链接也没説具体操作；
   打开Apps – CytoCluster，选择 OH-PIN algorithm ，点Analyze current network。结果显示在另一个面板上，有一些clusters，按由大到小排列。比如我们想分析第一个cluster的物种属性，选择cluster1，点Creat sub-network，可查看该子网按之前物种颜色分类的结果。

5. 联合环境因素分析  Neighbors of environmental parameter
   选择pH点(没找到，再点邻近的点，可找到相pH正或负相关的OTU

结论 Conclusions

1. 网络是精糙无标度(适应结点度分布的权力法则)和小世界(路径长度短特点);

2. 如果只看正相关边，网络分为两个主要的簇，由不同的分类学群主载；

3. 如果看pH值的邻近节点，发现两个负相关的簇：一个与pH正相关，另一个相反；
   对于生物学观点，全局网络属性意义不大。然而，网络形成两个物种分类学特异的簇，暗示苔原土壤存在两个不同的微生物群落。人类也观察到在肠道和阴道中有明显不同的微生物群落。可变的微生物群落是有争意的，因为不清楚群落是否真的不同，还是梯度的渐变。我们可以接受这两种差点，因为有一些部分是重叠的。
   当探索临近的pH结点，我们看到Solibacteres和Acidobacteria在其中一个正相关簇中占主导，并与pH呈负相，意味着它们喜欢酸性环境。我们看到另一个簇中Chloracidobacteria和Alphaproteobacteria占主导，且与pH正相关。这些微生物更喜欢基础环境。
   结论是土壤pH驱动微生物群落改变。与数据原文结论一致。
   此外，我们还发现了更细分类单元与pH的相关性。如Acidobacteria门中的Chloracidobacteria纲与pH正相关，是该门中的特异的纲。结果可以根据pH反苔原土壤中的主要细菌门类。

名词解释 Resources

1. CoNet无向网络：为什么CoNet返回的是无向网络用于选择配置。答案是所有5个选择相似、不相似和相关测量是不对称的，相似的A与B与B与A是相同的。

2. CoNet和Cytoscape中心节点的检测：找有最多正或负相关边的节点，在Node table中，点Degree即按其排序，找到最多度的点。

3. 从随机千分文件中恢复CoNet网络 Restore the CoNet network from random score files：为了基于之前计算好的permutations and bootstraps文件而生成网络。

4. 正相关边的聚类：为什么只聚类正相关的边，因为我们感兴趣在一起的物种共有一些特征。大部分聚类算法不能区分正或负相关的边，负相关的也会聚类在一起。

5. Cytoscape中选择正相关边：Select -> Use filter(找不到, choose “edge.interactionType” as column and click “Add”. Select “copresence” and click “Apply Filter”. Go to Select -> Nodes and click “Nodes connected by selected edges”. Go to File -> New -> Network and click “From selected nodes, selected edges”. Finally, layout the network (e.g. Layout->yFiles Layouts-> Organic).

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