MPB：中大魏泓组-??无菌小鼠肠道粪菌移植(视频)

图1：粪便悬液的制备。A：200mg小鼠粪便样本。B：样本用2mL无菌氯化钠溶液 (0.9%) 稀释。C：涡旋5分钟得到重悬液。D：离心后得到沉淀和上清液。E：保留上清液，去除沉淀。

9)立即将离心所得粪便悬液按照无菌传递要求传入隔离器内，对无菌小鼠进行粪菌移植。未使用的粪便悬液在洁净工作台内进行分装并冻存。

注：5）-7）为可选步骤，主要用于粪便中含有未被消化的食物残渣等大颗粒较多的特殊粪便悬液制备。

4.1粪便悬液分装保存

1)开启洁净工作台，紫外灯灭菌30分钟。开启洁净工作台风机15分钟。

2)将离心后的试管以及无菌1.5mL离心管外包装用酒精擦拭消毒后放入洁净工作台。

3)在粪便悬液中加入10%无菌甘油，用封口膜将离心管密封后可在-80℃超低温冰箱中冷冻保存1-8周。

2.动物粪便样本

参照人粪便样本。但猪、猴、牛、马、大熊猫等动物粪便样本易含有未被消化的食物残渣等大颗粒，一般需要5）-7）步骤。

3.细菌样本

3.1 根据细菌的不同特性，选择合适的培养基，在特定温度和培养条件下进行细菌培养。冻存的菌液样本置37.5℃复苏10分钟后使用；菌冻干粉加入对应培养基后，置37.5℃复苏10分钟后使用。

3.2 一般细菌在培养后的8-10h达到对数期，用移液枪从对数生长期培养物中吸取1mL菌液于分光光度计样品池中，用紫外分光光度计检测OD600值（Optical Density）并确定菌液浓度。当OD600≈1时，菌液浓度约10⁸-10⁹cfu/mL。细菌原液以6000×g 离心5分钟后，去除上清液并将沉淀重悬于无菌PBS中制成约10⁸-10⁹cfu/mL细菌悬液。将该稀释菌液样本分装于灭菌离心管内密封，按照无菌传递要求将该样品传递进入隔离器内对动物进行灌胃。

3.3 取新鲜菌液或复苏后的菌液样本进行微生物灌胃移植 (微生物的肠道定植受粪便采取方法、处理温度、空气暴露时间等影响较大，所以菌量只是影响定植的一个环节，一般不进行严格要求) ，每周灌胃移植2次，一般菌群的定植周期约为一周，单菌或特殊致病菌的定植周期为2-4周。可依据SPF级小鼠预实验结果调整灌胃剂量和周期。

3.4 粪菌移植前和粪菌移植后7天分别收集新鲜小鼠粪便样品并称重。将200mg新鲜粪便样本溶于2mL无菌PBS中形成原液。原液涡旋5分钟，对于涡旋不能分解的样品再用匀浆机匀浆至无明显大颗粒。用无菌PBS (或脑心浸液肉汤培养基) 进行连续稀释，取1mL原液用9mL无菌PBS稀释制成一级稀释液，取1mL一级稀释液用9mL无菌PBS稀释形成二级稀释液，重复此步骤3-5次得到逐级稀释液，并将逐级稀释液分别接种在选择性培养基上培养18-24h后观察生长情况，以确定每克粪便中细菌的浓度。菌群移植7天后菌群定植情况见图2，单菌移植7天后单菌定植情况见图3。

图3：单菌移植前后小鼠粪便样本培养情况。A：单菌移植前将无菌小鼠粪便样本接种在哥伦比亚血平皿上，培养24h后无菌落生长。B：单菌移植7天后，小鼠粪便10倍稀释液在哥伦比亚血平皿上培养24h后的菌落生长情况。C：100倍稀释液在哥伦比亚血平皿上培养24h后的菌落生长情况。D：10000倍稀释液在哥伦比亚血平皿上培养24h后的菌落生长情况。

二、无菌小鼠灌胃

1.按照物品无菌传递要求，将密封装有菌液样品的离心管传递进入隔离器内。

2.提前将8号或10号小鼠灌胃针和1mL注射器经高温高压灭菌后，按照物品无菌传递要求传入无菌隔离器内。

3.用1mL注射器吸取菌液，将灌胃针与注射器相匹配，详细操作见视频1。

4.打开笼盖，用右手拇指和食指提起小鼠尾巴中部，并将小鼠放置在笼盖上。

5.称量小鼠体重，根据小鼠体重进行灌胃，灌胃量约为10μL/g。以每只无菌小鼠体重平均20g为例，小鼠灌胃的体积约200μL，菌量约2×10⁷-2×10⁸cfu。每次使用仅打开一次，未用完丢弃。

6.用左手拇指和食指第一、二指节抓住无菌小鼠耳后的颈部皮肤将其拎起，用无名指和小指夹其背部皮肤和尾部将其固定，同时应防止动物窒息。使其头、颈和身体呈直线。

7.灌胃针头从动物嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有刺空感。

8.将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，回抽注射器无空气逆流方可注入菌液。

9.观察动物的反应，如无过度挣扎，可尝试推注，如阻力较小可推注所有药物，如阻力过大或动物反应剧烈，呼吸受阻，可缓解后再进行灌胃操作。

10.松开动物，观察动物呼吸，如无呼吸异常，可确定灌胃成功。

11.为提高微生物移植效果，可用等量菌液对小鼠下腹部和背部皮肤进行涂抹（以皮肤被毛浸湿为准），小鼠可通过自身或相互舔舐摄取菌群；对于未断奶仔鼠的微生物移植，可在母鼠乳头部位涂抹菌液。

注：样本量根据具体实验方案和动物数量自行调整(200mg粪便/只/次) 。常规菌群移植实验一周内灌胃2-3次(致病菌除外) 可完成定植，仔鼠由于灌胃量较少，可灌胃3-5次完成定植。

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来源：刘永鑫Adam