图1. 土壤线虫DNA提取流程示意图。（相关结果来自课题组先前发表的文章（Du et al.,2020））
三、线虫群落的扩增测序
1.使用引物NF1-F/18Sr2b-R（Porazinska et al., 2009）对线虫18S rDNA V4区进行扩增。PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μl反应体系：5 × FastPfu Buffer 4 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，Forward Primer （5μM）0.8 μl，Reverse Primer （5μM）0.8 μl，FastPfu Polymerase 0.4 μl，BSA 0.2 μl，Template DNA 10 ng，最后使用灭菌PCR水补足至20 μl。
2.线虫（NF1FF/18Sr2bR）PCR反应参数为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循环后最终在72 ℃终延伸10 min。扩增之后，PCR产物使用2 %琼脂糖凝胶电泳进行可视化（图2），使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）进行纯化，并使用QuantiFluor?-ST（Promega, USA）对回收产物进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina, San Diego, USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 300文库。PCR文库构建是在引物上合成barcode，采用混合样品建库的模式。具体构建文库的步骤为: （1）连接“Y”字形接头；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；（4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行双端测序。原始数据已上传至NCBI数据库（序列号：PRJNA580055）。
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来源：刘永鑫Adam
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