短乳杆菌鸟氨酸转氨基淀粉酶酶学性质的定点突变研究

氨基甲酸乙酯(EC)自然存在于大多数发酵食品和饮料中，但对实验动物有致癌和致突变作用。尿素和瓜氨酸是氨基甲酸乙酯主要的前体物质，精氨酸脱亚胺酶(ADI)、鸟氨酸转氨基淀粉酶(OTC)和氨基甲酸激酶(CK)通过ADI途径参与代谢精氨酸形成瓜氨酸。氨酸转氨淀粉酶(OTC)通过催化瓜氨酸生成鸟氨酸和氨甲酰磷酸参与精氨酸的降解。文章旨在通过Discovery Studio软件对OTC酶进行指导改造，使之提高酶活性和热稳定性。

先将短乳杆菌氨酸转氨淀粉酶与瓜氨酸使用CDOCKER进行分子对接，对结合位点附近氨基酸进行丙氨酸扫描。

表1 丙氨酸扫描

再根据突变能量筛选出H140、Q143 和D236对其进行饱和突变，再次筛选出H140A, H140W, Q143A, Q143F, Q143W, Q143Y, D236A, D236W和D236R这9个虚拟突变体，通过定向突变试剂盒，将突变体序列插入pET28a载体进行表达并纯化。

表2 饱和突变

将表达的各突变体OTC酶液与瓜氨酸混合后置于不同的温度及pH环境下，以测的最佳反应温度和pH值。再通过T50值得测量来确定各突变体的热稳定性。将纯化的酶液置于不同乙醇浓度(0%、2.5%、5%、10%）的缓冲液中培养以监测其乙醇耐受性。

图2 各突变体的最适温度和pH

表3 OTC极其突变体的热稳定性

来源：东方科软（北京）科技有限公司