ACS Sustainable Chem.Eng.|提高工程漆酶在甜菜碱类天然深共熔溶剂中的热稳定性

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正月十五

宵

今天推送的文章是发表在

ACS Sustainable Chemistry&Engineering

上的“

Enhancing the Thermostability of Engineered Laccases in Aqueous

Betaine-Based Natural Deep Eutectic Solvents

”，通讯作者是那不勒斯大学农业科学系的Cinzia Pezzella。

漆酶是一种广泛存在的多铜氧化酶，它催化多种酚类和非酚类底物的氧化，并伴随氧还原成水，这是唯一的反应副产物。氧化的自由基性质导致活性自由基物种作为主要氧化产物，可通过降解和合成过程进化。漆酶在工业过程中应用的挑战之一是它们能够保持较长时间的活性或在恶劣的操作条件下生存，因此需要重新设计酶以微调其性质以适应最终应用，从而提高生产效率和酶性能。最近，柔性表面环已被确定为通过应用针对其硬度的修饰来提高酶热稳定性的潜在目标。提高酶热稳定性的另一种补充方法包括通过培养、挖掘或宏基因组方法探索微生物多样性来寻找极端酶。另一方面，酶在固体载体上的固定化已成为实现工业过程中酶的后合成开发、促进酶的重复使用和回收的关键技术，同时提高了酶的热稳定性。

深共熔溶剂(DESs)是氢键受体(HBA)(如铵盐)和氢键供体(HBD)(如多元醇和糖)的混合物，与其单个组分相比，熔化温度显著降低。DESs的一个子集，称为NADESs，完全使用天然原料(如糖和氨基酸)制备。DESs作为无毒溶剂因其具有低易燃性、低挥发性、易制备、高溶解性和与酶的相容性等吸引人的特性而得到广泛应用。更有趣的是，DESs作为共溶剂还可以防止通常在有机溶剂中观察到的酶失活。

深入了解DES组成对酶稳定性和活性的影响，将有助于为特定的生物催化过程量身定做这些绿色溶剂。为了更深入地了解这种结构-功能之间的函数关系，本文尝试了一种基于对接模拟的计算机辅助方法。以Pleurotus Ostreatus的POXA1b漆酶为靶酶。它是一种高氧化还原漆酶，因其适合工业生产的特性而被广泛应用于不同的领域，如在很宽的pH值(3?9)和温度(25?65℃)范围内的稳定性和活性，以及在异源宿主中的高产量水平。更重要的是，作者已经开发了一系列具有改良表型的进化突变体，其中5个在本工作中被测试以研究NADES效应。

HBD对漆酶活性的影响。在T.versicolor漆酶最新研究结果的基础上，选择了5 种基于甜菜碱的 NADES NADES 培养基，在25wt%的水稀释条件下对POXA1b漆酶及其5个突变体的热稳定作用进行了测试(表1)，以充分挖掘这一系列突变体在广泛领域的应用潜力。NADES 基于甜菜碱作为 HBA，山梨糖醇、木糖醇、甘油、乙二醇或赤藓糖醇作为 HBD，比例为 2HBA:1HBD。将POXA1b 及其变异体在25℃培养基中培养10min，并与对照液(pH=7的50mM磷酸盐缓冲液)的相对活性进行比较。所有酶的活性几乎与参考溶液中的相同，最大增强 20%。这些结果证实了甜菜碱能够保护蛋白质免受失活和聚集，并提高基于甜菜碱的 NADES 中的漆酶活性和稳定性。

表1

HBD对漆酶在70℃下热稳定性的影响。当在70℃的NADES中孵育时，所有受试漆酶的热稳定性都有显著提高(图1)。虽然不同的HBD对酶的残留活性有不同的影响，但所有使用的NADES都是有益的。在大多数情况下，漆酶在25 wt% 2Bet:1Sor NADES 溶液中表现出更高的热稳定性。在25 wt% 2Bet:1Sor NADES溶液中，在70℃下孵育 60 分钟后，NADES 的存在使 POXA1b 的残留活性增加了四倍（65% vs 16%）。对于 EV1 和 EV5，由于在相同的 NADES 溶液中孵育而观察到类似的有益效果，而 25 wt% 2Bet:1Xyl NADES 溶液是 EV3 和 EV4 最有利的 NADES 培养基。

图1

HBD和HBA在水相中的缔合作用。在研究NADES组分与漆酶的相互作用之前，分析了水中HBD和HBA的相互作用，以了解液相中是否存在单独组分或簇状NADES。图2显示了山梨醇和甜菜碱分子在水和真空中的平均作用力(PMF)随质心之间分离距离的变化。在真空中，PMF曲线显示，当间隔为4.4?时，自由吉布斯能量的最小值约为?4.7kcal mol^?1。这意味着这两个分子之间的净相互作用是有利的，导致在真空中与有利的范德华相互作用和静电相互作用相结合。有趣的是，在水中计算的相同的PMF曲线没有显示出任何自由能最小值，这表明这两个分子之间的缔合在水中不再受欢迎。从热力学的角度分析，结果表明，由于水化过程的不利贡献，在水中可能形成的复合物(山梨醇?甜菜碱)被阻止了。事实上，复合物的水合作用不如分别水合山梨醇和甜菜碱。本研究中考虑的其他多元醇具有类似的结构，并会与甜菜碱和水产生类似的相互作用。因此，HBA和HBD在水中以孤立的分子形式存在，而对于NADES与漆酶的相互作用的研究，将只评估单个NADES组分与酶之间的相互作用。

图2

漆酶?HBD相互作用的计算分析。为了了解NADES组分在漆酶热降解稳定性中的作用，进行了分子对接计算。在POXA1b蛋白模型中引入了每个POXA1b变异体的有区别的替换，并通过YASARA软件最小化了各自的能量。计算了每对漆酶变体和每个HBD的最佳漆酶?HBD复合物构象的结合能分布(kcal mol ^-1)，并与70℃下残余活性测量的结果进行了比较(图3)。所有酶的剩余活性与结合能呈正相关(相关系数在0.660-0.965之间)，结合能越正，剩余活性越高。特别是，山梨醇、木糖醇和赤藓糖醇对结合能的贡献程度相似，山梨醇的结合能略高。反之，乙二醇在结合能方面表现出较差的稳定效果。这一行为在所有被测试的酶中都是相同的。还计算了每个漆酶?甜菜碱复合物的结合能，但不同酶之间的结合能没有显著差异，估计值为3.32±0.12kcal mol^?1。漆酶蛋白模型上NADES组分的定位如图4所示。在野生型POXA1b中，甜菜碱、山梨醇、木糖醇和赤藓糖醇在L1环的同一区域相互作用，连接结构域2和3，而乙二醇位于活性部位，这可能解释了该分子稳定作用较差的原因。相反，与甘油的相互作用发生在蛋白质表面的不同区域。在EV1中，会出现一幅不同的交互图景。甜菜碱似乎与活性位点相互作用，特别是与该变体的突变残基H162相互作用。木糖醇、甘油和赤藓糖醇与L1环暴露区域上的相同残基相互作用，而乙二醇被预测与L1环的内部相互作用，从而解释了其对EV1几乎没有稳定作用。有趣的是，与山梨醇相互作用所涉及的残基，导致了这种HBD观察到的最高结合能，可以确定稳定相互作用的潜在目标。EV2、EV3和EV4展示了类似的交互场景。事实上，甜菜碱定位于蛋白质表面，而与山梨醇、木糖醇、甘油和赤藓糖醇的相互作用发生在L1环上，类似于EV1和POXA1b。

图3

图4

从NADES效应中获益最多的漆酶变体EV5也表现出一种特殊的相互作用模式。特别是，甜菜碱似乎定位在C-末端区域，非常接近P494T突变，以前被证明是导致该变体较低的蛋白质灵活性，从而导致其内在热稳定性的原因。有趣的是，引起最佳稳定效果的木糖醇和山梨醇在L1环中相互作用，尽管与该环中观察到的其他相互作用相比，木糖醇和山梨醇在不同和特殊的区域相互作用。这可能表明，虽然L1环代表了NADES相互作用的共同目标，但它们的稳定作用严格依赖于每个变体的构象变化。可以预见，NADES对EV5变异体诱导的最高稳定性是由每个HBD建立的协同作用以及甜菜碱在不同的相互作用位点上的定位所致。此外，对于EV5变体，很明显，稳定效果随着多元醇HBD的羟基数量的增加而增加，就像在ChDHP和甜菜碱基DES中观察到的T.versicolor漆酶一样。

25 wt% 2Ber:1Sor NADES 组分对漆酶70℃热稳定性的影响。为了评估漆酶对高温稳定性的增强是由于NADES的单个成分还是由于 HBD 和 HBA 的联合作用，分别制备了与 25 wt% 2Bet：1Sor相同浓度的甜菜碱和山梨糖醇。漆酶在这些水溶液中在 70℃下孵育，并评估了它们的热稳定性（图5）。在15 wt% 甜菜碱中孵育增加了漆酶的热稳定性，而在10 wt%山梨糖醇中孵育几乎没有或没有改善。相反，当酶在25 wt% 2Bet:1Sor NADES 溶液中孵育时，漆酶的热稳定性获得最高的增益。特别是，EV5 变体在70℃下在NADES溶液中孵育60分钟时保留了80%的活性，而在两种单一组分存在下保留了40%的活性，从而证实了HBD和HBA的组合效应NADES对提高热稳定性的影响。表2 报告了7070℃下有或没有 2Bet:1Sor NADES 预孵育的漆酶的半衰期。与参考溶液相比，它们的半衰期至少增加两倍，如EV4和EV5的情况。此外，EV1和EV3的半衰期延长了三倍，而POXA1b和EV2的半衰期延长了近四倍。特别是，在 NADES 溶液中孵育时，EV5和EV2在70℃下表现出最长的半衰期。

图5

值得注意的是，NADES的热稳定作用对于每种酶变体都是非常特异的。虽然从相似的t_1/2开始，但对于所有的酶来说，实现的增量是不同的，这指出了蛋白质和NADES组分之间所建立的相互作用的特异性的重要性。为了进一步了解观察到的实验数据，用FoldX方法计算了每个漆酶变异体相对于野生型POXA1b的氨基酸取代引起的吉布斯自由能值(ΔΔG，kcal mol^?1)的变化。氨基酸取代对EV5变异体的有益影响(ΔΔG=?8.35kcal mol^?1)，而对其他变异体几乎可以忽略不计。因此，NADES的作用似乎在进一步促进已经耐热的酶(如EV5的情况)和补偿更不耐热的酶(如EV2的情况)方面都是有效的。

25 wt % 2Ber:1Sor NADES 对漆酶90℃热稳定性的影响。评估了25 wt% 2Bet:1Sor NADES对漆酶热稳定性的积极影响，将孵育温度提高到90℃（图6）。总的来说，即使在90℃下在NADES中的孵化促进了所有测试漆酶的热稳定性提高。特别是，EV5 显示出最高的残留活性，在25 wt% 2Bet:1Sor 中孵育3分钟后增加了近45%。

图6

整理：李岚雪

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.1c07104?ref=PDF

来源：饲料用酶结构生物学