植物lncRNA研究：中国小麦花叶病毒感染本氏烟草的长链非编码 RNA

注：本文用google直接翻译

2. 材料和方法

2.1.植物生长和病毒感染条件

本实验采用模式植物本氏烟草。本氏烟草植物在温室中生长，温度为 25±2°C，相对湿度为 70%，光照周期为 16 小时/黑暗周期为 8 小时。CWMV 完全感染克隆是在我们的实验室中构建的 [ 31 , 32 , 33 ]。将CWMV感染克隆注射到处于四叶期的本氏烟草植物。为了确认这种感染是否成功，我们通过定量逆转录 (RT)-PCR 测量了 CWMV 的积累。

2.2.RNA 提取、文库构建和 RNA 测序

在接种后 7 天收集叶样品并在液氮中快速冷冻。使用 CWMV 感染和未处理的样本进行 RNA-seq，每个处理评估三个独立的生物学重复。使用 RNAprep Pure Plant Kit（天根，北京，中国）从叶子中提取总 RNA。由于某些 lncRNA 不包含 polyA 尾，因此根据制造商的说明使用 Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) 去除了总 RNA 的 rRNA。cDNA 文库构建和 RNA 测序由诺安公司（中国杭州）在 Illumina HiSeq 4000 系统上进行。

从本氏烟草的不同组织中分离出总 RNA根据制造商的说明使用 TRIzol 试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的植物；每个样品包括三个独立的生物学重复。根据制造商的说明，使用 First Stand cDNA Synthesis Kit（TOYOBO，Osaka，Japan）将纯化的总 RNA（1 μg）逆转录为 cDNA。使用 AceQ RT-qPCR SYBR Green Master Mix Kit（Vazyme，南京，中国）通过定量 RT-PCR（qRT-PCR）分析这些 lncRNA 的相对表达水平。每个 q RT-PCR 样品包含 10 μL 2× SYBR PCR master mix、1 μL 正向和反向引物 (10 μM)、0.5 μL cDNA 和 ddH2O，体积为 20 μL。所有反应均在 7900 实时 PCR 系统（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）上一式三份进行。定量 PCR 程序如下：95°C 10 min，然后是 95 °C 15 秒、60 °C 20 秒和 72 °C 30 秒的 40 个循环。每个处理评价3个生物学重复和3个技术重复，本实验以泛素结合酶基因作为内参。所有 lncRNA 的相对表达水平使用 2?△△Ct法 [ 32 , 33 ]。用于 qRT-PCR 的所有引物都列在补充表 S1 中。

2.3.LncRNA 的转录组装、定位和鉴定

为了获得干净的读数，我们过滤了原始序列以去除适配器、低质量读数和污染序列。使用 HISAT2 软件将干净读数映射到本氏烟草基因组，并使用 String Tie 组装转录本。为了获得这些转录本的位置关系信息，使用 Cufflinks 软件将它们与已知的 mRNA 和 lncRNA 进行比较，然后使用 Cuffmerge 进行组装。每千碱基百万片段是衡量基因表达水平的重要指标。我们根据以下标准将转录本视为 lncRNA：序列长度 > 200 bp，每百万碱基片段的表达水平 > 0.5，外显子数 > 2，覆盖度 > 1。将新组装的转录本与本氏烟草进行比较使用 Cuffcompare 软件删除了参考基因组注释、带注释的转录本和其他 ncRNA 转录本。为了将来评估潜在的 lncRNA，我们使用了三个预测软件包（编码潜力计算器、txCdsPredict 和编码非编码索引）来预测它们的转录本编码能力。那些具有显着编码能力的被删除。

2.4.差异表达基因分析及靶基因预测

使用 Sting Tie 软件计算 lncRNA 和编码基因的表达水平。边缘 R 考虑了LncRNA 的差异表达（p < 0.05 和 |fold-change| > 2）。基于 lncRNA 的调控模式，我们预测了它们的潜在靶基因。最近，lncRNA 的调控模式被分为顺式和反式作用组。lncRNAs上游或下游100kb区域的编码基因选择为顺式– 目标基因。根据lncRNA的表达水平预测其反式靶基因，编码基因与RNA表达水平的相关性是确定反式调节因子的重要依据。为了进一步了解 lncRNA 及其相应靶基因的功能，对 DElncRNA 的推定靶基因进行基因本体 (GO) 术语和京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路富集分析。

2.5.LncRNA、MiRNA、mRNA调控网络的构建

为了确定 lncRNA 是否充当潜在的 microRNA (miRNA) 前体，使用 Blast 工具将 DElncRNA 与 miRBase 数据库进行比对，并选择显示超过 90% 同源性的 lncRNA 和 miRNA 前体进行进一步研究。使用 psRNATarget 在线工具（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/，2020年 5 月访问）预测潜在 miRNA 的靶基因。使用Cytoscape 3.7.1软件构建lncRNAs、miRNAs和miRNA靶基因的调控网络。

还构建了一个共表达网络，以使用 STRING 数据库（http://string-db.org/，于 2020 年 7 月访问）描述 lncRNA 与靶基因之间的关系。从数据库中提取目标基因列表构建共表达网络。由于本氏烟草中lncRNAs与靶蛋白的关系不明确，我们根据靶基因序列通过Blastx选择参考蛋白序列，并基于参考物种（拟南芥）的已知相互作用构建网络。lncRNAs和靶基因之间的关系对的数据被导入到Cytoscape 3.7.1中。使用 Cytoscape 软件获得和调整共表达网络。

2.6.载体构建和 CWMV 感染

烟草脆裂病毒 (TRV) 介导的基因沉默系统用于沉默 lncRNA [ 26 ]。沉默片段是使用 SGN VIGS 网络服务器（http://vigs.solgenomics.net/，于 2020 年 8 月访问）设计的。XLOC_006393 的大约 300 bp 片段被克隆并通过双酶消化（BamHI和SmaI）插入到 TRV-RNA2 载体中。将 TRV-VIGS 构建体（包含 TRV1 和 TRV2：XLOC_006393）转化到根癌农杆菌菌株 GV3101 中。转化的根癌农杆菌菌株 GV3101 用于浸润本氏烟草的叶子根据杨等人描述的方法，在四叶期幼苗。[ 32 ]。空 TRV2 (TRV:00) 和 TRV1 用作阴性对照。在 VIGS 植物中，XLOC_006393 的表达水平被沉默，阴性对照植物分别受到 CWMV 感染。CWMV 接种方法如 2.1 所述。

为了进一步分析NbmiR168c的潜在靶基因，我们克隆了NbAGO1开放阅读框，其中包含NbmiR168c结合位点。通过双酶切将含有限制性位点的NbAGO1开放阅读框插入pCAMBIA1300-sGFP载体中，得到NbAGO1 :GFP融合表达载体。NbmiR168c前体序列通过PCR获得，PCR产物和pCAMBIA1300载体用消化SacⅠ和XbaⅠ，并且它们使用T4DNA连接酶来产生结扎NbmiR168c矢量。将所有质粒转化到根癌农杆菌中通过电穿孔法菌株 GV3101。对于本氏烟草中农杆菌介导的瞬时表达，农杆菌细胞在含有 50 μg/mL 卡那霉素、50 μg/mL 庆大霉素和 50 μg/mL 利福平的 YEP 肉汤培养基中于 28°C 培养过夜。将培养的细胞以 5000 x g 收集 5 分钟，然后重新悬浮在浸润缓冲液（1 M KCl、100 mM MES 和 10 mM 乙酰丁香酮 (As)）中。然后将所有农杆菌细胞在室温下孵育 2 小时，OD 值范围为 0.6 至 1.0。混合农杆菌细胞用于在四叶期共转化本氏烟草。48小时后在紫外光下观察GFP的荧光强度。

2.7.蛋白质提取和蛋白质印迹分析

将约 1 g 组织样品在液氮中研磨，然后加入 1 mL 蛋白质提取缓冲液（提取缓冲液含有 100 mM Tris-HCl、pH 8.8、60% SDS 和 2% β-巯基乙醇）和蛋白酶抑制剂混合物片（每 50 毫升蛋白质提取缓冲液 1 片；罗氏，巴塞尔，瑞士）。通过在 4°C 下以 18,000×g 离心 20 分钟收集所有样品的上清液。上清液在沸水中孵育 5 分钟，然后通过 12.5% SDS-PAGE 分离。通过电泳分离总蛋白质并转移到硝酸纤维素膜（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）。针对 CWMV CP 的抗体用于检测不同处理后的 CWMV 积累。将膜与抗 CP 多克隆抗体和二抗（与碱性磷酸酶偶联的抗兔山羊 IgG）在室温下孵育 1 小时，然后用 TBST 洗涤膜。使用 Molecular Image ChemiDoc Touch（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）可视化 CWMV CP 信号。

3. 结果

3.1.本氏烟草中 LncRNA 的全基因组鉴定

为了系统地鉴定本氏烟草中的lncRNA ，我们在接种 CWMV 植物和野生型植物后 7 天 (dpi) 使用 Illumina 测序平台进行了高通量链特异性 RNA-seq。Illumina测序产生了超过630,783,694个reads，去除低质量reads后获得了626,749,541个干净reads，包括那些含有q质量分数低于20的测序接头和测序引物和核苷酸（表格1）。

表格1

RNA-seq 数据摘要。

lncRNA计算识别方法和过程的整合见于 图1[ 7 ]。首先，我们使用六个完整的转录组 ssRNA-seq 数据集构建了一个基于高通量链特异性 RNA-seq 的本氏烟草lncRNA 管道。表格1）。所有干净的读数都是使用 Trinity从头组装的，它产生了 196,798 个转录本，平均长度为 1139 bp。总共产生了 65,144 个 unigenes，平均长度为 839 bp。这些转录本和 unigenes 的大小分布显示在图2A. 对于注释，使用 BLASTX 针对六个蛋白质数据库（非冗余 (NR)、GO、Swiss-Prot、KEGG、Pfam 和 KOG）搜索了 196,798 个转录本，截止 E 值为 10 –5以排除转录本可能编码蛋白质。我们分别在 Swiss-Prot、NR、Pfam、KEGG、KOG 和 GO 蛋白质数据库中注释了 135,068、222,956、170,648、92,179、188,840 和 116,847 个转录本（表 S2）。我们接下来评估了剩余转录本的编码潜力并确定了新的 lncRNA。为了消除蛋白质编码转录本，HMMER 被用于扫描所有三个阅读框架中的每个转录本单位，以排除那些编码在 Pfam 蛋白质家族数据库中编目任何已知蛋白质结构域的那些 [ 11 , 34]]。此外，考虑到 lncRNA 序列（≥200 nt）的特征及其与其他类 RNA（mRNA、转移 RNA、rRNA、小核 RNA、小核仁 RNA、pre-miRNA 和假基因）的差异，我们将使用 Rfam 软件 [ 35 ]转录成不同的亚型。最后，使用编码潜力计算软件 [ 36 , 37 , 38 ]分析每个转录本的编码潜力。仅保留在这些计算中得分≤-1 的转录本，给出 1175 个 lncRNA 候选（表 S3、表 S4 和文本 S1）。新型lncRNA的外显子数主要为2~4个，新型lncRNA的ORF长度主要为150~250 bp。这些结果显示在图2乐队 图2C. 另外，如图 图2D，我们对这些新发现的 lncRNA 类型的分析表明，大约 76.7% 的新型 lncRNA 主要是长基因间 ncRNA。

图1 用于系统识别受中国小麦花叶病毒感染的本氏烟草中长链非编码 RNA (lncRNA) 的流程的一般流程图。

图2 本氏烟草mRNA和lncRNA的特征。( A – C ) 这些转录本中不同长度的 lncRNA 和 mRNA 的数量、外显子数量和已鉴定的 lncRNA 和 mRNA 中的开放阅读框长度密度特征；（D）在本氏烟草的叶子中鉴定了不同类型的 lncRNA ，包括基因间 lncRNA、反义 lncRNA（与已知转录本具有外显子重叠的 lncRNA）、sense_overlapping lncRNA（与已知转录本具有通用外显子重叠的 lncRNA）和 sense_introic lncRNA（具有已知转录物的内含子和外显子区域的 lncRNA）。

3.2.本氏烟草 LncRNA 响应 CWMV 感染的表征和表达分析

使用 RSEM 软件 [ 39 ]对所有 lncRNA 的表达标准化为每千碱基转录本每百万映射读数的读数进行全局检查。为了识别对照检查 (CK) 和 CWMV 样本之间差异表达的本氏烟草lncRNA，将那些具有大于 2 倍变化和错误发现率 < 0.05 的样本视为差异表达。CK和CWMV样本中共有65个lncRNA差异表达，分别包括42个和23个上调和下调的lncRNA。图 3和 图 3B)。这些来自六个样本的重要 lncRNA 被用作层次聚类的特征 [ 40 ]，将样本分为两组。这些结果表明 lncRNA 在三个生物学重复中具有良好的重复性，可用于后续分析。

图 3 鉴定了本氏烟草中对中国小麦花叶病毒的差异表达的 lncRNA 反应，并通过 qRT-PCR 验证了不同组织中差异表达的 lncRNA (DElncRNAs) 的表达水平。( A ) 创建火山图以区分 DElncRNA，垂直线表示 2 倍上调或下调，水平线表示p = 0.05。红色和蓝色点分别代表上调和下调的 lncRNA。（B）基于 CK 和 CWMV 感染样本之间 DElncRNA 的表达谱数据构建热图（log 2|折叠变化| > 2 和错误发现率 < 0.05)，蓝色和红色分别代表不同样本中下调和上调的 lncRNA；（C）通过qRT-PCR验证部分DElncRNA。（D）通过 qRT-PCR 分析了不同组织（包括根、茎、叶和花）中部分 DElncRNA 的表达水平。基于qRT-PCR结果构建热图，红色和蓝色代表lncRNAs在不同组织中的高低表达。

3.3.通过 qRT-PCR 鉴定本氏烟草 LncRNAs

通过 RNA-seq 鉴定的 20 个 DElncRNA 通过 RT-PCR 测量它们的表达水平进行验证。如图所示图 3C、XLOC_006393、XLOC_030708、XLOC_030801、XLOC_047700、XLOC_056844、XLOC_062761、XLOC_064893、XLOC_065000、XLOC5000、XLOC27000、XLOC5000、XLOC27000、XLOC20400、70777777004、XLOC5的表达水平显着升高。然而，A4A49_16865、A4A49_22746、A4A49_35842、XLOC_000037、XLOC_019534、A4A49_66050、XLOC_002153和XLOC_004979感染后的表达略有下调。结果与 RNA-seq 表达模式一致，表明这些 DElncRNA 在本氏烟草对 CWMV 感染的反应中起主要作用。

3.4.本氏烟草 LncRNA 的组织表达谱

为了理解DElncRNAs在不同组织，XLOC_004979，XLOC_030708，XLOC_065054，XLOC_067237，XLOC_047700，XLOC_006393，A4A9_22746，A4A9_35842，XLOC_002153，XLOC_004262，XLOC_068538和XLOC_056844水平表达模式在根部进行了检查，茎，叶和花通过qRT -聚合酶链反应。如图所示图 3D，大多数lncRNAs的表达水平在叶和花中上调，在根和茎中下调。在叶子中，只有 XLOC_067237 和 A4A9_22746 略微下调，而其他 lncRNA 显着上调。值得注意的是，XLOC_067237 和 A4A9_22746 在花中显着上调，表现出比其他组织高得多的表达水平。然而，除了 XLOC_004979、XLOC_030708 和 XLOC_065054 之外，几乎所有的 lncRNA 在根和茎中都被下调。这些结果表明，评估的 lncRNA 在植物生长和发育阶段很重要。

3.5.LncRNAs 目标基因 (LTGs) 的 GO 和 KEGG 富集分析

LncRNA 通过调节其顺式和反式靶基因来发挥生物学功能。共调节在13211个靶基因的顺式-和反式-被预测为63个DElncRNAs，其中299是顺-regulatory和12912分别为反式-regulatory。为了进一步了解这些 lncRNA 的机制，所有预测的靶基因都通过 GO 和 KEGG 富集分析进行了注释。LTGs 的富集分析显示 119 个 GO 术语在细胞成分、分子功能和生物过程中富集。图 4一种）。53个GO术语在生物过程中得到丰富，其中代谢过程（GO：0008152）、细胞过程（GO：0009987）、初级代谢过程（GO：0044238）和细胞代谢过程（GO：0044267）最多丰富的GO术语。在分子功能水平上，GO术语在催化活性（GO：0003824）、离子结合（GO：0043167）和转移酶活性（GO：0016740）方面显着丰富。在这些 GO 术语中，细胞成分类别中最丰富的 GO 术语是膜 (GO:0016020)、膜部分 (GO:0044425) 和膜内在 (GO:0031224) (图 4A-C)。为了更好地理解这些 lncRNA，使用 KOBAS 软件通过 KEGG 通路分析检查了所有 LTG。结果表明，这些LTGs在55个不同的途径中显着富集（图 4D)，其中最丰富的LTGs主要富集在四个途径：次生代谢物的生物合成、植物激素信号转导、碳代谢和CWMV感染后植物病原体相互作用。

图 4 GO 和 KEGG 通路富集分析差异表达的 lncRNAs (DElncRNAs) 响应中国小麦花叶病毒Nicotiana bethamiana。为了分析 DElncRNA 的功能，我们预测了这些 DElncRNA 的潜在靶基因，并通过 GO 和 KEGG 通路分析对其进行了评估。这些潜在的靶基因被单独富集到生物过程 ( A )、细胞成分 ( B )、分子功能 ( C ) 和 KEGG 通路 ( D )。Rich 因子是该通路术语中注释的差异表达基因数与该通路术语中注释的所有基因数之比。Q 值是校正后的p-值范围从 0 到 1，值越低表示强度越大。圆圈代表富集基因的数量，数字越大表示富集基因越多。

3.6.CWMV感染过程中lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建

以往的研究表明，lncRNAs可以通过多种RNA介导的基因调控机制来调控基因表达，其中lncRNAs在重要的调控机制中充当miRNA前体。为了确定 lncRNA 是否是 miRNA 的前体，将所有 lncRNA 序列与 miRBase 数据库进行比对，以使用 Blastn 筛选 miRNA 前体。8个表达的lncRNA被鉴定为3个完全已知的miRNA前体（图S1），其中只有lncRNA XLOC_006393在CWMV感染中显着差异表达。序列比对分析表明，XLOC_006393可以作为一个miRNA前体起作用NbmiR168c. 此外，我们使用 RNAfold Web 服务器分析了 lncRNA 转录本的二级结构。结果表明 XLOC_006393 含有稳定的 miRNA 前体茎环结构。为了更好地理解 DElncRNAs 的功能，我们使用 Cytoscape 构建了一个 DElncRNAs-miRNA-mRNA 调控网络。表达调控网络揭示lncRNAs可以通过调控一种或几种miRNAs的表达水平间接调控下游mRNA的表达。此外，这些靶基因的功能注释表明，一些基因参与了 RNA 介导的基因沉默和脱落酸介导的信号转导。综上所述，lncRNAs 作为 miRNAs 的主要调节因子并参与许多生物过程。

3.7.沉默 XLOC_006393 抑制 CWMV 在本氏烟草中的积累

研究 lncRNA XLOC_006393 在本氏烟草中对 CWMV 感染作出反应的潜在生物学功能。我们使用 VIGS 方法构建了 lncRNA XLOC_006393 沉默植物。与阴性对照相比，XLOC_006393在VIGS植株中的表达水平降低了50%以上。我们选择了三种 VIGS 植物（#2、#4 和 #7）和 CWMV 感染的阴性植物。在感染后 21 天，我们在 #2、#4 和 #7 植物中观察到比 TRV: 00 植物更严重的花叶症状。此外，从 CWMV 感染的本氏烟草植物中提取总基因组 RNA，通过 qRT-PCR 检测病毒积累。TRV中CWMV外壳蛋白的积累：XLOC_006393植株与对照组相比显着减少（图 5一种）。蛋白质印迹还显示 TRV：XLOC_006393 植物叶片中积累的 CWMV CP 蛋白少于对照叶片中的 CWMV CP 蛋白。图 5C）。这些结果表明 XLOC_006393 在本氏烟草对 CWMV 感染的反应中起主要作用。

图 5 通过病毒诱导的基因沉默验证 XLOC_006393。( A ) CWMV感染后不同时间点（0、7、14、28天）XLOC_006393、NbmiR168c、NbAGO1的表达量分析；（B，C）通过qRT-PCR和Western blotting（WB）检测了不同植物材料中CWMV CP的积累，包括TRV：NbmiR168c，TRV：NbAGO1，TRV：XLOC_006393和TRV：00，其中考马斯亮蓝（ CBB) 用于计算不同样品的蛋白质含量——图 S2 和 S3中的全 WB 图像。* 和 ns 分别表示两个样本之间存在显着性和无显着性差异；( DCWMV 感染 30 天后，不同植物材料的叶子中相继形成轻度绿色花叶病灶。底部照片是（D）的方框部分的放大图。这些植物材料包含 Mock、TRV:00、TRV:XLOC_006393、TRV:NbAGO1 和 OEXLOC_006393。

预测结果表明XLOC_006393可以作为NbmiR168c的前体。为了进一步分析XLOC_006393的功能，我们预测的潜在靶基因NbmiR168c。结果表明，多个NbAGO1基因可以结合和切割 NbmiR168c。我们分析的表达水平NbmiR168c，NbAGO1 CWMV感染定量RT-PCR后，和XLOC_006393。NbmiR168c和 XLOC_006393 表达水平在 CWMV 感染后的不同时间点显着上调。图 5一种）。然而，在 CWMV 感染后的这些时间点，NbAGO1表达下调，并与NbmiR168c和 XLOC_006393呈负相关。为了验证这些结果，我们构建了 35S:XLOC_006393 过表达转基因植物和 TRV: NbAGO1植物。我们发现 TRV: NbAGO1和 35S:XLOC_006393 植物在 CWMV 感染后表现出比 TRV:XLOC_006393 植物更严重的花叶症状（图 5D)。此外，TRV: NbAGO1和35S:XLOC_006393植株叶片中CWMV CP的积累量显着高于对照和TRV:XLOC_006393（图 5C）。这些结果表明 XLOC_006393 通过充当NbmiR168c前体对 CWMV 感染作出反应，可以调节NbAGO1 的表达。

3.8.NbmiR168c通过体内转录后过程调控NbAGO1的表达

为了进一步验证NbmiR168c及其潜在靶基因NbAGO1的调控机制，将NbAGO1编码序列融合到植物表达载体中 GFP 的上游，生成 pCAMIBI1300-35S- NbAGO1- GFP 作为报告基因。将NbmiR168c前体序列插入植物表达载体 pCAMIBI1300 而不是 GFP 基因，所得载体 pCAMIBI1300-35S- NbmiR168c用作效应子（图 6一种）。如图所示图 6B、C，在NbAGO1 -GFP 和NbmiR168c共注射后，GFP 荧光显着减弱。然而，叶子被同样混合的含有NbmiR168c和NbAGO1 -GFP 的GV3101 细胞浸润。我们还分析了共注射后 GFP 在转录本和蛋白质水平上的表达。当NbmiR168c和NbAGO1 – GFP共注射时，GFP的表达水平显着降低。此外，GFP蛋白积累水平远低于共注射NbmiR168c和NbAGO1 – GFP后的水平。这些结果表明NbmiR168c可以识别NbAGO1 并在转录水平调节其表达。

图 6 NbmiR168c通过体内转录后过程调节NbAGO1表达。( A ) NbAGO1-GFP融合表达载体和NbmiR168c表达载体的构建；( B , C ) 不同载体叶片浸润部位的GFP荧光强度；（D，E）在不同载体瞬时感染 48 小时后，通过 qRT-PCR 和蛋白质印迹法在不同的本氏烟草叶片中检测到 GFP 的积累-图 S4 和 S5 中的全 WB 图像。* 和 ns 分别显示两个样本之间存在显着差异和无显着差异。

5。结论

越来越多的研究表明，lncRNAs 在植物生长发育以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥着重要作用。然而，lncRNAs在植物病毒感染中的作用相对未知。在这项研究中，在感染 CWMV 的本氏烟草中发现了 1175 个新的lncRNA。其中，65个lncRNAs，包括42个lncRNAs上调，23个lncRNAs下调，在CWMV感染后表现出差异表达。根据GO和KEGG通路富集分析，这些lncRNAs主要富集在植物激素信号转导和其他通路中。此外，CWMV感染后XLOC_006393的差异表达可能是NbmiR168c的前体，它可以通过调节其靶基因NbAGO1的表达来应对 CWMV 感染。

来源：植物研究阅读笔记