自动尿液分析系统

自动尿液分析将物理化学分析、机载离心和数字成像结合在一个系统中：cobas 6500 尿液工作区的多中心性能评估

我们评估了全自动cobas 6500尿液工作区及其自动化组件（cobas u 601和cobas?u 701）的分析性能。

设计和方法

该研究在三个欧洲中心使用未离心的剩余常规尿液样本进行;所有测量均在样品收集后2小时内进行。根据临床和实验室标准协会指南评估精密度、样品残留和方法比较。方法比较：cobas u 601与Urisys 2400和cobas u 411尿液试纸;以及 cobas u 701 与 KOVA? 视觉显微镜和 iQ200 分析仪的对比。使用问卷评估可操作性和功能。

结果

整个cobas 6500系统的精度在预定义的验收限值内，没有观察到明显的残留。红细胞、白细胞、亚硝酸盐和蛋白质与cobas u 411反射计一致（≥93%）。cobas u 701分析仪与KOVA红细胞视觉显微镜之间存在高度相关性（RBC;斜率，0.89;皮尔逊r，0.95）和白细胞（WBC;斜率，0.96;皮尔逊r，0.96），证明了测试结果的等效性。cobas u 701分析仪的97.5%百分位参考值为5.3个细胞/μL（RBC）和6.2个细胞/μL（WBC）。cobas 6500 系统对小细菌 （>1 μm） 和病理管型表现出良好的灵敏度，用户界面、维护向导和系统设计受到操作员的高度评价。

结论

cobas 6500 系统的全自动工作流程、高精度和高通量有可能促进尿液筛查的标准化。

关键词：临床自动化， 自动化生物学—高通量筛选， 实验室管理—工作流程

1. 引言

尿液分析是临床实践中非常常用的技术，提供有关肾脏和其他器官系统功能的关键信息，并有助于各种疾病的临床决策，例如糖尿病，肾小球肾炎和疑似尿路感染（UTI）. 常规尿液分析涉及初始肉眼检查后的两步法，包括对尿沉渣进行理化评估和显微镜检查，以区分和量化临床相关的尿液颗粒[[14]，[15]，[16]，[17]，[18]]。物理化学检查技术通常涉及折光率/折射率法，用于使用尿液试纸分析物测定比重和反射光谱。

尿液试纸通常用作UTI的首次诊断分诊，阳性结果可触发更具体的分析，例如通过尿培养鉴定细菌种类[19，20]。通过组合各个参数的结果，可以提高试纸的灵敏度;例如，亚硝酸盐和/或白细胞阳性结果诊断UTI的敏感性为68%-88%，具体取决于患者群体和临床环境[21]。最近的一项研究发现，老年住院患者诊断亚硝酸盐和/或白细胞阳性UTI的敏感性要高得多，为97%[19]。然而，试纸缺乏精确性，文献报道了诊断UTI的不同预测值[[20]，[21]，[22]];因此，已经提出了自动化方法来提高精度，准确性和吞吐量，特别是在具有多个操作员的环境中[23]。~60%的病例仍使用手动显微镜检查，被认为是尿沉渣颗粒分析的参考方法[24]。然而，手动显微镜检查需要高水平的操作人员专业知识，并且需要耗费人力和时间，需要明确定义的分析前步骤来避免潜在的有害偏差[25]。使用手动显微镜进行尿沉渣分析还具有高变异系数（CV;>100%）以及观察者之间和观察者内部的变异性，特别是当由非熟练操作员进行时。

自1970年代以来，已经开发了自动尿液分析仪，以整合尿液的理化和显微镜检查[33，34]。这些系统提供实用且快速的尿液筛查，可防止不必要的培养要求[35]。与手动方法相比，这些仪器的通量更高，能够可靠、快速地筛查尿液样本，同时减少对实验室工作人员的劳动力需求，从而提高效率和成本效益[36，37]。此外，这些仪器可以通过消除操作员之间的可变性来提高可靠性和精度，并且需要低样品量。已经开发了两种广泛的技术用于自动尿沉渣分析：尿流式细胞术]和使用内置相机的基于图像的显微镜。对新开发的自动分析仪进行严格评估以确保其性能与当前参考方法（即手动显微镜）相似，这一点很重要。一些自动化系统的已知局限性包括细菌、管型和晶体的准确性有限[36，39]。因此，有必要在新仪器中提高整个尿液分析范围的准确性。

下一代cobas? 6500尿液分析仪（罗氏诊断有限公司，德国曼海姆）将物理化学试纸分析和基于图像的微观尿沉渣分析集成到一个平台中。由于其模块化设计，各个子系统可用作独立的尿液分析仪（cobas u 601）或独立的显微镜分析仪（cobas u 701），或组合为全自动尿液工作区。虽然该系统自动分析尿液颗粒，但也可以存储显微图像以供进一步的人工审查。我们进行了一项多中心研究，以评估cobas 6500尿液工作区及其模块化组件的分析性能，并使用统一的指定比较方法比较各个子系统。还评估了独立模块和集成系统的可操作性和实用性。

2. 材料和方法

2.1. 研究设计

该研究于 2013 年 5 月至 2014 年 5 月在三个欧洲中心进行，涵盖不同的患者群体和广泛的颗粒浓度：两个公立大学医院实验室（荷兰莱顿莱顿大学医学中心;西班牙塞维利亚圣母玛卡丽娜大学医院）和一个商业实验室（西班牙维拉德卡瓦尔斯的CatLab）。

所有测量均使用常规检测中超出所需量（≥5 mL）的天然人尿样本进行;匿名样本用于精度和相关实验，假名样本用于参考范围研究（仅记录性别）。排除了含有任何添加剂的样品或在特定时间段内收集的样品（例如24小时尿液样本）。根据欧洲尿液分析指南进行样本储存和处理[14]。样品在室温下储存，不经过任何处理或离心，并在样品收集后2小时内进行分析。之后将用过的样品在2–8°C下储存1天。

患者样本的使用符合所有相关的国家法规和机构政策。在研究开始之前，三个研究地点的负责伦理委员会（莱顿大学医学中心委员会 Medische Ethiek [编号：C13/146];维珍玛卡丽娜大学医院伦理委员会[内部代码：2014];对CATLAB质量管理的评估）证实，不需要正式的伦理批准，因为研究中只使用了常规测试的剩余样品。

2.2. Cobas 6500、Cobas U 601 和 Cobas U 701 分析仪

cobas 6500 尿液工作区提供全自动尿液分析，由 cobas u 601 和 cobas u 701 模块化子系统组成，每小时可处理多达 116 个完整的尿液结果（试纸 + 沉淀物）;Cobas 6500 测试参数及其缩写显示在图1.

图1

COBAS 6500 参数及其缩写。

cobas u 601分析仪是一种反射光度法尿液试纸分析仪，它还提供用于测定透明度和比重的物理细胞测量。它的通量高达每小时 240 个样品。试纸以cobas u包的形式提供，每包数量为400条。

cobas u 701分析仪采用数字显微成像技术，用于尿液沉渣颗粒的定量、半定量和定性检查。使用未旋转的尿液进行测量。使用高效的移液模式（三次吸液和冲洗）在一次性塑料比色皿中对 170 μL 尿液进行样品测量，以确保最佳的样品混合。cobas u 701移液后的自动化工作流程和示例结果图像如图 2.

图 2

cobas u 701分析仪样品处理工作流程图（上图）。将填充的比色皿（图像1和2）短暂离心（260×g下10秒）以获得单层颗粒（图像3）。然后显微镜自动记录高分辨率图像（图像4）;自动图像评估模块（AIEM）使用15张图像（图像5）进行分析，该模块利用基于神经网络的算法（图像6）。AIEM包括生成最终结果的不同阶段，使用概率图，然后与特征图像数据库进行比较（图7）。每张图像的评估大约需要 3-4 秒。来自cobas u 701分析仪的结果图像示例（下图）。补充材料 S1 中显示了其他图像。红细胞，红细胞;SEC，鳞状上皮细胞;白细胞，白细胞。

2.3. 比较方法

cobas u 411 和 Urisys 2400 分析仪（罗氏诊断有限公司，德国曼海姆）是使用反射光度法的尿液试纸分析仪。Urisys 2400 试纸盒与 Urisys 2400 分析仪一起使用，Combur [10] Test? M 试纸盒与 cobas u 411 分析仪一起使用。

使用KOVA?腔室技术的视觉显微镜（货号3518345001，Kova International Inc.，Garden Grove，CA）是欧洲尿液分析指南的标准化方法[14]，被用作三个评估中心的统一比较方法。制备每个样品的两张KOVA载玻片，并使用明场显微镜进行计数，每张载玻片由两名经验丰富的操作员进行计数，以减少计数误差;然后计算平均值。有关KOVA程序的更多详细信息，请参阅补充材料S2。

iQ200分析仪（Iris Diagnostics，加利福尼亚州查茨沃斯）是第二代自动显微镜分析仪，可从平面尿颗粒流中捕获图像。神经网络（自动粒子识别?）用于对样品中的粒子进行分类和量化;从每个尿液样本中拍摄500张照片，并与标准图像进行比较。

2.4. 研究评估

测试分三个阶段进行，首先评估 cobas u 601 分析仪，然后评估 cobas u 701 分析仪，最后评估 cobas 6500 尿液工作区。根据临床和实验室标准协会指南评估精密度（重复性和中间精密度）、样品残留（根据Broughton等人[44]）和方法比较。阴性和阳性质量控制样本（qAntify?对照和Liquichek?尿液分析对照;Bio-Rad Laboratories Ltd，英国沃特福德）和人尿样本用于重复性测试。选择人体样品以涵盖每次测试的相关浓度范围;每个样品进行21次测量。由于人类样品的稳定性有限，单独使用对照样品进行中等精密测试。

对cobas u 601分析仪与Urisys 2400和cobas u 411尿液试纸系统进行方法比较，对cobas u 701分析仪与KOVA视觉显微镜和iQ200分析仪进行方法比较。对于细菌参数，由于据报道iQ200系统在检测小细菌球菌方面存在局限性，因此仅在cobas u 701分析仪和KOVA视觉显微镜之间进行了比较[45，46]。

通过稀释强阳性样品，评估cobas u 701分析仪上非鳞状上皮细胞、透明管型、鳞状上皮细胞和细菌的预定义半定量浓度范围的回收率。为了避免与稀释相关的问题，例如细胞裂解，将样品分成两部分;将第二部分离心，其上清液用作第一部分的稀释剂。所有样品（包括原始样品、制备的稀释液和用过的稀释剂）一式三份测量。

cobas u 701 分析仪包括操作员用于图像重分类的软件。所有操作员都进行了重新分类，以确认软件功能并评估对统计结果计算的影响。所有站点都进行了≥10次重新分类。

使用来自明显健康供体的尿液样本估计cobas u 701分析仪上定量参数（红细胞[RBC]和白细胞[WBC]）的参考值。通过使用三种不同的方法测量样品来确定健康的尿液状态：试纸读数（cobas u 601分析仪），iQ200分析仪和使用KOVA计数的视觉显微镜。

cobas u 601 和 cobas u 701 分析仪之间的一致性测试使用 626 个常规样品进行，两个系统上的红细胞、白细胞、亚硝酸盐和蛋白质试纸结果均为阳性。

在整个研究过程中，不断评估cobas 6500尿液工作区的系统功能和实用性。每天对多达 1000 个样品进行常规模拟和工作流程实验，以评估该系统是否适合大容量临床实验室需求。操作员使用从1（非常差）到5（优秀）的排名量表回答问卷，以评估可用性和功能。

2.5. 统计分析

所有数据均使用基于Windows的计算机辅助评估（WinCAEv）工具（罗氏诊断国际有限公司，瑞士罗特克罗伊茨）进行记录和分析。对于cobas u 601分析仪的精密测试和cobas u 701分析仪的定量参数，计算了平均值，标准偏差（SD）和CV;对于Cobas U 701分析仪的半定量和定性参数，计算了测试浓度范围的一致性率。通过比较受影响的样品与参考部件的结果，对残留测试进行统计分析。通过计算一致率或戴明回归（比重，cobas u 601与Urisys 2400）来评估cobas u 601分析仪的方法比较结果。使用Bland-Altman差分图和Passing-Bablok回归分析（包括皮尔逊r和Kendall的Tau相关系数）对定量参数（RBC和WBC）评估cobas u 701分析仪的方法比较结果;计算半定量参数的一致率（最佳拟合;±1 个相邻范围;总体）;以及计算半定量和定性参数的敏感性和特异性。为了估计来自明显健康个体的样本的参考值，使用 cobas u 701 分析仪和 KOVA 视觉显微镜计算红细胞和白细胞的平均值以及第 97.5 和第 99 个百分位值。

4. 讨论

目前的多中心研究表明，自动尿液分析可以在多个部位和所有测试参数上以高通量精确和准确的方式进行。如本研究和先前的报告所示，新型cobas 6500系统能够可靠地检测细菌、酵母菌和病理管型，并且始终显示出比iQ200分析仪更高的灵敏度（具有相似的特异性）[11，37]。因此，cobas 6500系统符合这些参数的灵敏度标准，假设这些参数至少为80%[37]。对病理管型的高敏感性对于急性肾损伤的早期发现尤为重要[11]。cobas 6500 系统在实验室中也表现出出色的精度，21 天中级精度的个体内 CV （CVi） 始终低于 10%。这优于美国病理学家学院的一项调查中手动显微镜检查显示的实验室间CV，其中发现红细胞和WBC计数的操作员间CVi分别为21-42%和15-58%[49，50]，并且与标准治疗理化分析相似[51]。因此，临床上可接受的尿液分析表现标准需要反映目前的治疗标准表现估计值[52]。随着新技术的发展和美国病理学家学院标准的后续更新，自动尿液分析仪的性能可能会进一步提高，正如在其他疾病领域观察到的那样（例如，血红蛋白A的性能标准）1分) [例如，目前尿蛋白含量的精确目标被假定为CVi 20%（最佳）和CVi 25%（理想）[54]。

cobas 6500系统为完整的尿液分析提供了精确可靠的工具，cobas u 701分析仪的通量为每小时116个样本，比其他自动化技术和手动显微镜更快[43]。独立式 cobas u 601 分析仪的通量为每小时 240 个样品。我们的研究结果补充了以前的研究，这些研究表明cobas 6500系统可以减少周转时间和工作量[43]，并且cobas u 701分析仪可用于UTI的快速筛查[55]。

在评估新的医学检查时，首先要明确该检查旨在解决的未满足的临床需求，以及检查的目的和在临床护理路径中的作用[56，57]。尿液分析是临床实践的一个组成部分，提供有关肾脏/泌尿生殖系统和其他器官系统功能的重要信息，并且是临床实验室诊断测试菜单的重要组成部分.尿液分析通常用作筛查测试;然而，尿沉渣的手动显微镜检查需要高水平的专业知识，并且需要大量时间和人力[25]。此外，许多临床实验室的工作量需求不断增加，通常是在资源有限和财务限制收紧的背景下[[58]，[59]，[60]]。因此，需要提高尿液分析测试的效率和成本效益，重点是提高样品通量、易用性和周转时间，同时保持结果的准确性和可重复性。这些因素还可以通过减少检测和结果可用性之间的时间来改善患者护理，从而减少治疗开始或出院的延迟。

cobas 6500尿液工作区旨在通过整合尿液的物理化学和显微镜分析，消除操作员之间的可变性，提高样品通量并减少对实验室工作人员的资源需求来满足这些临床需求。此外，cobas 6500系统的模块化特性为不同实验室环境中具有不同需求的用户提供了替代选择。例如，组合平台可能特别适用于具有预分析阶段的实验室，该阶段不允许在2小时内分析尿液样本（其中与尿液试纸分析仪进行交叉检查的能力可能是必不可少的），而cobas u 701分析仪可用作医院环境中的独立筛查分析仪，这些分析仪对生物样本具有完整的跟踪和追溯功能，并且需要在保证的周转时间内快速获得结果次。重要的是，cobas 6500 平台能够在常规初级保健和学术环境中快速可靠地筛查四种关键尿液参数（红细胞、白细胞、细菌和蛋白质）。根据欧洲尿液分析指南[14]，尿液筛查这四个参数需要很高的分析灵敏度，以避免假阴性结果，同时也旨在限制假阳性。应该注意的是，cobas u 601和cobas u 701分析仪之间存在一些差异，这可能是由于使用的方法不同。例如，裂解的细胞仍可通过试纸分析检测，而在显微镜图像中不再可见[61]。此外，亚硝酸盐阴性细菌的检测只能通过显微镜分析来实现[61]。然而，在cobas 6500尿液工作区域中，这两种方法的结合确保了操作员的最佳识别和信息。

cobas u 701分析仪基于类似于手动显微镜的方法原理，使用二维图像来识别尿沉渣颗粒，但与手动显微镜相比，可能会遗漏高密度样品中的一些颗粒。在我们的研究中，cobas u 701分析仪表现出可接受的重复性和中等精度。该分析仪的移液功能具有三个吸液和冲洗循环，以确保最佳的样品混合，可能有助于观察到良好的精度。尽管在cobas u 701分析仪上对透明铸件进行低阳性测量时有两个临界恢复结果，但由于原始数据的典型不精确性，从连续值到离散值的任何比较都可能提供错误的分配。从临床角度来看，透明管型不被认为对任何疾病过程都有指征性，因为在健康、浓缩的尿液标本中可以看到增加的数量（每低倍视野0-5个颗粒通常定义为透明管型的参考值，可以考虑生理性）[62]。

cobas u 701分析仪筛查某些尿液参数（如管型、晶体和畸形红细胞）的能力仍然有限，需要通过手动显微镜进行进一步分析，以准确鉴定复杂样本中临床相关的尿液颗粒[37，[63]，[64]，[65]，[66]，[67]，[68]，[69]，[70]].重要的是，cobas系统通过对自动图像进行视觉审查，有助于重新评估复杂样品。在不清楚的情况下，图像被标记，操作员可以手动评估存储的图像。自动识别1μm大小的细菌（例如革兰氏阳性球菌）的图像也会被存储起来，以供以后的手动检查（补充材料S8），因为这些细菌很难用其他自动化解决方案识别[71]。与其他自动尿液分析仪相比，这已被证明可以减少对传统手动显微镜的要求，从而减少操作人员的工作量和周转时间[43]。这一特征在学术中心和教学医院中可能特别相关，与非学术中心相比，可能会遇到更高比例的带有异常颗粒的复杂尿液样本。尿液分析的快速响应时间对于与微生物学部门的有效合作也至关重要，以指导患者管理决策;对于疑似UTI患者，早期（10-15分钟内）尿筛查阴性可避免高达60%的尿培养[72]。最后，cobas u 701模块、iQ200系统和KOVA视觉显微镜对样品WBC含量的定量测定有较好的一致性。然而，我们的结果表明，与cobas u 701分析仪和KOVA视觉显微镜相比，iQ200系统低估了样品的红细胞含量。

我们的研究在三个欧洲中心进行，以确保正常和病理尿液样本的良好代表性。然而，尿液分析仪的性能可能因所调查的患者队列而异，因此应在预期使用人群中进行评估。例如，在初级保健机构与专科护理机构中，尿液样本的复杂性可能不同。

总之，我们已经表明，全自动cobas 6500尿液工作区符合欧洲尿液分析指南[14]推荐的分析质量规范，产生的结果与手动显微镜获得的结果相当，适用于常规临床实验室使用。此外，我们确认了各个模块化子系统（cobas u 601和cobas u 701分析仪）的出色性能，它们为具有不同临床需求的用户提供了替代测试选项。所声称的cobas 6500平台和每个子系统的总吞吐量得到证实，总体可用性高于当前使用的常规系统。

来源：医学镜界