姜达教授团队研究：基于1000个基因测序的EGFR-TKIs靶向治疗非小细胞肺癌患者预后相关的基因突变特征

编者按：【科研之声】栏目旨在展示、分享中国肿瘤领域科研工作者的学术成果。

近期，河北医科大学第四医院姜达教授团队领衔的研究——《基于1000个基因测序的EGFR-TKIs靶向治疗非小细胞肺癌患者预后相关的基因突变特征》正式发布，该研究可能发现了EGFR-TKIs治疗NSCLC的潜在预后标志物。

通讯作者

姜达 教授

河北省肿瘤内科诊疗中心主任、主任医师、博士研究生导师

河北医科大学第四医院肿瘤内科主任

河北省医疗质量管理与控制中心肿瘤内科专业主任

中国医药教育协会腹部肿瘤专业委员会副主任委员

北京肿瘤防治研究会转化医学分委会副主任委员

北京肿瘤防治研究会缓和医疗分委会副主任委员

CSCO血管靶向治疗专家委员会常委

张慧 医生

河北医科大学第四医院肿瘤学硕士、主治医师

河北省抗癌协会肿瘤转移专业委员会委员

河北省抗癌协会肿瘤转移专业委员会青年委员会委员

河北省肿瘤防治联合会肿瘤支持治疗专业委员会委员

河北省女医师学会肿瘤内科专业委员会委员

河北省女医师学会肿瘤免疫专业会员会委员

北京癌症防治学会胃癌防治青年委员委会委员

中国抗癌协会会员

金辉 医生

河北医科大学第四医院主治医师、硕士研究生

河北省抗癌协会会员

河北省肿瘤防治联合会肿瘤支持治疗专业委员会常务委员

河北省肿瘤防治联合会肿瘤免疫治疗专业委员会委员

河北省抗癌协会肿瘤精准治疗专业委员会委员

中国老年医学学会舒缓医学青年委员会委员

研究摘要

背景：表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的应用可能会受体细胞基因突变的影响。本研究旨在探讨基因突变对EGFR-TKIs治疗的NSCLC患者预后及肿瘤标志物的影响。

方法：选取21例接受EGFR-TKIs治疗的NSCLC患者，对肿瘤组织或全血样本的1000个基因进行测序，对突变基因进行功能富集分析，并分析了突变与临床指标、预后、肿瘤标志物的相关性。比较了EGFR p.T790M阳性和阴性突变的NSCLC患者服用奥希替尼后的预后；同时筛选了EGFR p.T790M共突变和少见突变基因。

结果：共检测到251个基因的485个突变，研究显示MTOR、AXIN2、AR、EGFR、NOTCH1和HRAS基因突变与无进展生存期（PFS）和/或肿瘤标志物显著相关。接受奥希替尼治疗的EGFR p.T790M阳性和阴性患者的PFS等预后因素无显著差异。此外，我们还发现了EGFR p.T790M的80个共突变和54个少见突变基因。

结论：AR、HRAS、EGFR、AXIN2、NOTCH1、MTOR基因突变可能是影响EGFR-TKIs治疗NSCLC预后的关键基因。奥希替尼对EGFR p.T790M阴性NSCLC患者有一定疗效。

关键词：非小细胞肺癌，EGFR-TKIs，预后，EGFR p.T790M，NGS

选自：Neoplasma. 2022 Mar;69(2):352-360.

doi: 10.4149/neo_2021_210914N1307. Epub 2022 Jan 28.

肺癌的整体分子特征检测扩展了我们对细胞起源和分子途径的理解，其中许多基因变化代表了药物开发的潜在治疗靶点^[1]。EGFR-TKIs是一类针对EGFR突变的药物，研究表明EGFR-TKIs的应用受EGFR突变类型的影响^[2]。由于个体差异较大，患者可能携带多种基因突变，不同突变类型的肿瘤对药物的敏感性不同。此外，随着新一代测序技术(NGS)的发展，检测到的基因突变的范围较前扩大，会发现更多可能影响药物疗效的突变。

一 患者和方法

患者的纳入和排除

收集了2017 – 2019年在我院接受吉非替尼、埃克替尼或奥希替尼治疗的患者。纳入标准：1)年龄≥18岁；2)经组织病理或细胞学证实为非小细胞肺癌患者；3)患者自愿进行1000组基因检测；4)治疗后评估疗效，获得治疗前及治疗中肿瘤标志物CEA、SCC、NSE、CA19-9、CY21-1、ProGRP等临床资料；5)按照签署知情同意书的标准入组。排除标准：1)标本收集不合格，2)基因检测资料不合格，3)临床资料缺乏，4)随访资料缺乏。21例NSCLC患者符合纳入标准。本研究经河北医科大学第四医院伦理委员会批准，所有患者术前均获得书面知情同意。

样本收集标准

采集每个患者的肿瘤组织或全血样本。外周血标本采用吸管采集，样本量≥10 ml；采集新鲜手术组织样本1~2份，40~50 mg，占肿瘤细胞的40%以上，坏死细胞≤10%；新鲜穿刺组织采样≥4针；用EDTA抗凝管采集3~5 ml外周血对照。

靶向NGS基因测序

用1000个基因板钳定位肿瘤组织或全血标本，对照相邻组织或白细胞(Supplementary Table S1)。检测类型包括基因点突变、插入缺失突变和相关的基因融合突变。组织测序深度大于400倍， ctDNA测序深度大于1000倍，最小检测频率为0.1%。采用基因组DNA提取试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)和QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)提取组织样本的基因组DNA和血浆样本的循环游离DNA (cfDNA)。使用agcourt AMPure XP beads (agcourt Biosciences, Beverly, MA, USA)进行尺寸选择，然后进行PCR扩增。使用SeqCap EZ MedExome富集试剂盒(Roche, Basel, Switzerland)捕获目标序列，随后使用SeqCap EZ Prime Choice探针(Roche, Basel, Switzerland)进行靶向富集，从1000个已知的癌症相关基因中捕获了1.1 Mb。使用Illumina HiSeq Xten测序仪(San Diego, CA, USA)对捕获的文库进行靶向测序。

突变分析

采用SOAPnuke对测序数据进行筛选，剔除低质量数据和含有Adapter的序列。测序数据通过Burrows-Wheeler Aligner软件映射到hg19参考基因组，进行肿瘤特异性体细胞突变检测。使用VarScan 2.4.3版本、MuTect 1.1.4版本和Genome Analysis Toolkit (GATK) 2.3.9版本检测单核苷酸多态性(SNPs)和插入/删除(Indel)。采用CONTRA 2.0.4版本进行基因拷贝数变异(CNV)估计，采用独立开发的程序进行融合突变分析。

功能富集分析

使用DAVID数据库(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) 6.7版 (
http://david.abcc.ncifcrf.gov/)和KEGG数据库 (http://www.genome.jp/kegg)进行基因本体(GO)术语和通路富集分析。p值< 0.05为截断标准。统计分析。采用SPSS统计23版(SPSS, Inc.，Chicago, IL, USA)进行统计分析。连续变量组间比较采用t检验，分类变量组间比较采用2检验或Fisher精确检验，用数字和频率表示。采用多元回归分析比较各基因的突变率。

二

结果

患者特征和突变

表1 21例 NSCLC患者的临床特征

所有患者共筛选出251个基因中的485个突变。确定突变分类的分布：错义突变(53%)、移码突变(23%)、框内缺失突变(18%)、剪接突变(3%)、无意义突变(2%)和置换突变(1%)。

表2 突变频率最高的前20个基因

其中，AURKA c.1075C>A和EGFR c.257 3T>G是突变频率最高的2个突变，分别为80%和55%。对于所有突变的基因，吉非替尼治疗的患者中有28个基因的突变与否有显著差异，埃克替尼治疗的患者中有3个基因的突变有显著差异，奥希替尼治疗的患者中有1个基因有显著差异。

图1 3种EGFR-TKI突变状态差异显著的32个基因和15个高频突变基因的突变图谱，删除4个重复。

右边的直方图显示了21例患者的突变比例。

左下方的黄色、绿色和红色分别表示吉非替尼、埃克替尼和奥希替尼的治疗。

显示了43个基因的突变情况，其中包括上述32个基因，以及所有患者中突变频率最高的前15个基因，重复被删除。

功能富集分析

将图1中的43个突变基因上传到DAVID中，鉴定有代表性突变的功能富集。共获得58个p值0.05的GO项(图2A)，包括38个生物过程(BPs)、10个细胞组分(CCs)和10个分子功能(MFs)。BPs主要富集于RNA聚合酶II启动子的转录正调控(p=0.001)、上皮细胞增殖正调控(p < 0.001)和凋亡过程负调控(p=0.002)中。CCs结果显示，43个基因主要富集于细胞核(p=0.003)、质膜(p=0.036)、核染色质(p < 0.001)和核仁(p=0.008)。MFs主要富集于ATP结合(p < 0.001)、染色质结合(p < 0.001)、RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性DNA结合(p=0.026)等。

图2 43个突变基因在所有患者中占比高、突变频率高的GO项(A)和KEGG通路(B)。

KEGG通路富集显示突变基因在39个通路显著富集(p < 0.05)，包括子宫内膜癌通路(p < 0.001)、肿瘤中心糖代谢通路(p < 0.001)、癌症途径通路(p < 0.001)、PI3K-Akt信号通路(p < 0.001)、ErbB信号通路(p < 0.001)等。图2B展示了所有富集的通路。

突变基因的临床意义

为了探讨这些突变基因的临床意义，我们进一步分析了43个基因的突变状态与肿瘤标志物和PFS的预后指标的关系。治疗前CEA、NSE、Cy21-1和ProGRP水平分别与49个突变基因、1个突变基因、3个突变基因和1个突变基因之间存在显著差异(表3)。

表3 与治疗前肿瘤标记物CEA、NSE、CY211及ProGRP相关的突变频率最高的前20个基因

在所有43个突变基因中，NOTCH1和MTOR突变状态与PFS显著相关(图3A、3B)。

图3 不同突变状态下治疗期间PFS显著的突变箱线图。

NOTCH1 (A)、MTOR (B)基因突变患者的PFS时间明显低于未突变患者。

在所有基因中，共有4个基因的突变与2个以上指标显著相关。其中，MTOR与大多数指标相关(治疗前NSE、Cy21-1、ProGRP水平及治疗期间PFS; p < 0.05)，NOTCH1与治疗前CEA水平及治疗期间的PFS有关，HRAS与治疗前CEA及Cy21-1水平有关，AR与治疗前CEA水平及治疗期间SCC水平变化有关(p < 0.05)。当这些基因发生突变时，患者的肿瘤标志物水平显著升高，而PFS显著降低。因此，考虑它们可能是NSCLC预后的关键。

EGFR p.T790M突变阳性和阴性的NSCLC患者使用奥希替尼治疗的预后 由于奥希替尼是作用于EGFR p.T790M突变的靶向药物，本研究比较了奥希替尼治疗EGFR p.T790M阳性和阴性患者的生存率，以及伴随EGFR p.T790M突变的少见突变。本研究中，5例患者使用奥希替尼治疗，1例出现EGFR p.T790M突变，疗效为部分反应(partial response ，PR)。4例EGFR p.T790M阴性患者的疗效分别为1例PR和3例稳定（stable disease，SD）。EGFR p. T790M突变阳性和阴性患者服用奥希替尼后的PFS（p=0.336)等预后指标均无统计学差异，这一结果提示提示奥希替尼对EGFR p. T790M突变阴性患者也有效。

此外，在EGFR p.T790M阳性患者中，我们发现80例患者存在EGFR p.T790M的共突变，包括SMARCA4 p.K1390Q(2.23%)、DNMT3A p.F755S(2.17%)、MTOR p.Y1450*(2.15%)

、TPMT p.L182R(1.84%)、UGT1A1 p.L2 48W(1.74%)、C11orf30 p.H431P(1.46%)等(表4)。其余4例EGFR p.T790M阴性患者中，1例为PR，3例为SD，同时伴有EGFR p.L858R(55%)、ARID1A p.P16del(2.83%) 、TP53 p.R248W(21.73%)和AR p.Q60L (4.24%)。且在所有突变中检测到54个少见突变，其中NOTCH1 p.Y813S(1.35%)、NOT CH1p.N109H(0.91%)和MTOR p.T314I (0.89%) 与PFS显著相关。

三

讨论

本研究通过1000个基因筛选EGFR-TKI治疗的NSCLC患者的突变，最终选择了43个与治疗药物显著相关和/或突变频率较高的基因(图1)，它们主要富集在子宫内膜癌、ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路和肿瘤中心糖代谢通路、癌症途径通路(图2A、2B)。

同时，为了明确这些基因的临床意义，我们分析了突变基因与PFS和肿瘤标志物水平(CEA、NES、Cy21-1、ProGRP和SCC)的相关性。AR、HRAS、NOTCH1、MTOR至少与两项指标显著相关，其中NOTCH1、MTOR与预后显著相关。

Android受体(AR)

AR基因缺失或缺陷会导致雄激素的全部或部分正常生物学作用丧失，进而导致雄激素不敏感综合征(androgen insensitivity syndrome，AIS)。目前AIS (http://Android mcgill.ca/)中报道的AR基因突变有数千个，包括全部或部分缺失、剪接区变异、插入或缺失引起的移码突变、错义或无意义变异引起的氨基酸替换或终止等。Xia等^[3]发现AR基因外显子2-8缺失的半合子变异是引起完全AIS的原因。Wu等^[4]在双胞胎产前诊断中检测到AR基因中一个新的突变C.3864t >C，这两个双胞胎都是该突变的半合子，具有典型的女性外生殖器和腹部双睾丸。然而，目前还没有AR在癌症中的突变的报道。

HRAS

RAS家族的激活成员KRAS、HRAS和NRAS在20% -30%的人类肿瘤中存在突变^[5]。HRAS的突变与多种肿瘤的发生密切相关。p.V112A和p.Q61R突变的HRAS可诱导小鼠发生结肠癌^[6]。Pandith等^[7]报道HRAS p.T81C的snp可增加膀胱癌(bladder cancer，BC)的发病风险，而罕见的TC + CC等位基因可作为晚期BC的预测预后的标志物。Sugita 等的研究^[8]发现，无论突变与否，HRAS在BC中的表达均显著上调。然而，与KRAS和NRAS相比，HRAS突变多见于BC和很多发病率低的癌症，如甲状腺嗜酸细胞肿瘤（Hurthle cell tumors，HCT）或精原细胞瘤^[9]。

NOTCH1

NOTCH1是已知的慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)的预后生物标志物。既往研究表明，NOTCH1突变的患者表现为生存差、耐药和疾病进展的风险升高^[10]。NOTCH1基因突变的存在与III期CLL的4.39倍风险相关，在中度风险的CLL患者中有报道^[11，12]。研究还发现10-15%的头颈部鳞状细胞癌患者存在NOTCH1突变，且与HPV状态显著相关(p=0.006)^[13]。

MTOR

MTOR基因编码MTOR蛋白，属于磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶家族。MTOR作为一个重要的调控基因，通过调节细胞周期、蛋白质合成、细胞能量代谢等发挥着重要的生理功能。它在细胞增殖、生长和分化^[14]中也起到了核心作用。共有559个MTOR突变记录在COSMIC数据库(
https://cancer.sanger.ac.uk/)中。虽然这些基因突变在NSCLC中的研究相对较少，但我们的研究证明它们具有一定的临床意义，这值得进一步研究。

研究发现，EGFR p.T790M阴性患者可受益于奥希替尼的治疗。例如，J?nne等^[15]观察到，88%的EGFR p.T790M阳性患者中位PFS为9.6个月，同时没有检测到EGFR T790M者, 69%的患者中位PFS为2.8个月。近期也有研究显示，p. T790M突变阳性和阴性患者PFS分别为10.8个月和5.1个月(p=0.007)， OS分别为22.5个月和13.4个月(p=0.002)^[16]。我们的结果提示EGFR p.T790M阳性和阴性NSCLC患者的PFS无显著差异（p>0.05），原因可能是：1)我们的研究中使用奥希替尼治疗的患者较少，只有1例EGFR T790M阳性，这可能造成了无统计学意义；2) EGFR p.T790M伴发的少见突变亦可能影响患者的生存。本研究中，我们在EGFR T790M阳性患者中检测到80个共突变，以及54个少见突变，包括BRAF、MET、CDK4、CDK6等。Blakely等^[17]研究发现，92.9%以上EGFR突变的肺癌患者在其他基因中有一个以上的共突变，其中10.2%被认为是共突变。EGFR共突变的功能驱动基因包括PIK3A、BRAF、MET、MYC、CDK6和CTNNB1。这些共突变的发生会影响Wnt/β-catenin通路和细胞周期相关基因CDK4和CDK6突变，进一步协同促进肿瘤转移或EGFR抑制剂耐药性。Hong等人^[18]发现，在NSCLC中，EGFR共突变与客观缓解显著相关(44% vs. 77%；p=0.01)， PFS缩短(6.20个月vs. 18.77个月；HR,3.51；p < 0.001)， OS较短(22.70个月vs.未达到；HR,4.65；P < 0.001)，多变量分析证实共突变是预后不良的独立因素。少见突变也可能与EGFR突变同时发生。有报道称，同时伴有HER2或MET E14跳跃性突变的EGFR突变患者对EGFR-TKIs的联合治疗^[19]反应良好。但是，TP53、PIK3CA等基因的突变也可能与EGFR的改变同时发生，导致EGFR-TKIs的治疗效果降低^[20-22]。

综上所述，这些数据肯定了研究EGFR T790M共突变和少见突变的重要性和必要性。

四

结论

本研究发现AR、HRAS、EGFR、AXIN2、NOTCH1、MTOR基因突变与EGFR-TKIs治疗的NSCLC患者预后及肿瘤标志物水平显著相关，其可能是EGFR-TKIs治疗NSCLC的潜在预后标志物。此外，奥希替尼对EGFR p.T790M阴性患者有一定疗效，但对于EGFR p.T790M合并罕见突变患者的治疗结果，还需要大样本的进一步研究。

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